李 牧 龔東亮 徐黎明 彭 榮

（1.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院檢驗(yàn)科，上海 201700；2.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院骨科，上海 201700）

乳腺癌是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，尋找乳腺癌的危險(xiǎn)因素和誘發(fā)因素，并加以控制，將對(duì)乳腺癌的防治起積極作用[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，病變細(xì)胞必須以特異性的修復(fù)機(jī)制來(lái)進(jìn)行修復(fù)[2]，而著色性干皮病基因組C（xeroderma pigmentosum group C，XPC）編碼的蛋白在早期DNA損傷修復(fù)中起關(guān)鍵作用[3]。為進(jìn)一步探討XPCrs2228000（Ala499Val）位點(diǎn)多態(tài)性在乳腺癌中的作用，本研究擬采用聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）檢測(cè)XPC基因，并分析XPCrs2228000位點(diǎn)多態(tài)性與乳腺癌發(fā)病的相關(guān)性。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2015年3月—2020年3月復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院女性乳腺癌患者562例（乳腺癌組），年齡（43.0±9.4）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)組織病理學(xué)檢查明確診斷為原發(fā)性乳腺癌。排除標(biāo)準(zhǔn)：1）合并其他腫瘤；2）不愿意參加本研究。另選取同期復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院體檢健康女性572名（正常對(duì)照組），年齡（45.0±10.2）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：1）與病例無(wú)親緣關(guān)系；2）體格檢查和實(shí)驗(yàn)室常規(guī)項(xiàng)目（血常規(guī)、肝功能、腎功能等）檢測(cè)均正常。本研究經(jīng)復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（青醫(yī)2022-59），所有研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)，自愿完成流行病學(xué)調(diào)查。所有患者自愿提供術(shù)前、術(shù)后、化療后的外周血樣本。

1.2 方法

1.2.1 問(wèn)卷調(diào)查

采用自主設(shè)計(jì)的問(wèn)卷進(jìn)行調(diào)查，收集所有研究對(duì)象的年齡、妊娠次數(shù)、分娩次數(shù)、婚姻狀況等一般資料，收集乳腺癌患者的絕經(jīng)情況、腫瘤類(lèi)型、雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）、BRCA1基因表達(dá)情況等臨床病理資料。

1.2.2 樣本采集

采集正常對(duì)照者體檢當(dāng)日和乳腺癌患者術(shù)前1周、術(shù)后（化療后）6周的空腹靜脈血樣本5 mL，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 儀器和試劑

全血DNA提取試劑盒、10×PCR Buffer、dNTP mixture、rTaqDNA聚合酶、10×T Buffer、限制性?xún)?nèi)切酶SacⅡ均購(gòu)自日本TaKaRa公司。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。DNA marker購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。TOne 96 G PCR擴(kuò)增儀（德國(guó)Biometra公司）。MF-ChemiBIS 3.2電泳凝膠成像分析系統(tǒng)（以色列DNR公司）。

1.2.4XPCrs2228000（Ala499Val）位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè)

采用全血DNA提取試劑盒提取DNA。采用Primer 3.0軟件設(shè)計(jì)DNA引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。上游引物為5'-TAAGGACCCAAGCTTGCCCG-3'，下游引物為5'-CCCACTTTTCCTCCTGCTCACAG-3'。以提取的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 2.0 μL，2.5 mmol/L dNTP 0.8 μL，10.0 μmol/L上、下游引物各1.0 μL，rTaq DNA聚合酶0.2 μL，DNA模版4.0 μL，ddH2O 11.0 μL。反應(yīng)條件：95 ℃5 min；95 ℃ 30 s，63.3 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR-RFLP酶切反應(yīng)體系：10×T Buffer 1 μL，0.1%牛血清白蛋白1 μL，限制性?xún)?nèi)切酶SacⅡ 0.5 μL，PCR 產(chǎn)物3 μL，ddH2O 4.5 μL。采用BeadXpress數(shù)碼微珠芯片系統(tǒng)（美國(guó)Illumina公司）進(jìn)行批量單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）位點(diǎn)檢測(cè)，通過(guò)Sequenom Typer4.0軟件（美國(guó)Sequenom公司）確定基因型。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。呈正態(tài)分布的計(jì)量資料以x±s表示，2個(gè)組之間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例或率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Logistic回歸分析評(píng)估XPCrs2228000位點(diǎn)多態(tài)性與乳腺癌發(fā)病的關(guān)系。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組與正常對(duì)照組一般資料比較

乳腺癌組和正常對(duì)照組年齡、妊娠次數(shù)、分娩次數(shù)、婚姻狀況差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表1。

表1 乳腺癌組與正常對(duì)照組一般資料比較

2.2 XPC rs2228000（Ala499Val）位點(diǎn)PCR擴(kuò)增結(jié)果

PCR酶切產(chǎn)物經(jīng)消化后在150 bp處產(chǎn)生特異性片段，見(jiàn)圖1。

圖1 PCR產(chǎn)物電泳圖

2.3 酶切產(chǎn)物電泳結(jié)果

采用限制性?xún)?nèi)切酶鑒定基因型，結(jié)果顯示，CC基因型在131 bp處有特異性條帶，TT基因型在150 bp處有特異性條帶。見(jiàn)圖2。

圖2 限制性?xún)?nèi)切酶酶切產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.4 乳腺癌組和正常對(duì)照組XPC rs2228000位點(diǎn)基因型和等位基因分布頻率比較

所有研究對(duì)象的基因型頻率分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律（乳腺癌組：χ2=0.038，P=0.781；正常對(duì)照組：χ2=1.512，P=0.237），具有群體代表性。

乳腺癌組和正常對(duì)照組CC基因型（野生型）、CT基因型（雜合型）、TT基因型（純合型）和等位基因（C、T）的分布頻率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見(jiàn)表2。

表2 乳腺癌組與正常對(duì)照組XPC rs2228000位點(diǎn)基因型和等位基因分布頻率比較

Logistic回歸分析結(jié)果顯示，以CC基因型為對(duì)照，CT和TT基因型個(gè)體乳腺癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)顯著增高[比值比（odds ratio，OR）值分別為1.36、2.44，95%可信區(qū)間（confidence interval，CI）分別為1.06～1.75、1.64～3.65]；以C等位基因?yàn)閷?duì)照，攜帶T等位基因的個(gè)體乳腺癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)顯著增高（OR=1.52，95%CI為1.37～1.94）。

2.5 XPC rs2228000位點(diǎn)多態(tài)性與乳腺癌患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性

ER陽(yáng)性、病理類(lèi)型為浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌的乳腺癌患者XPCrs2228000位點(diǎn)基因型分布分別與ER陰性、其他病理類(lèi)型（浸潤(rùn)性小葉癌、原位癌等）的患者比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；不同年齡、絕經(jīng)狀態(tài)、PR表達(dá)、BRCA1基因表達(dá)的乳腺癌患者之間XPCrs2228000位點(diǎn)基因型分布差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。以其他病理類(lèi)型（浸潤(rùn)性小葉癌、原位癌等）為對(duì)照，CT+TT基因型的乳腺癌患者病理類(lèi)型為浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌的風(fēng)險(xiǎn)增高（OR=2.3，95%CI為1.3～4.0）。以CC基因型為對(duì)照，CT+TT基因型的乳腺癌患者ER陽(yáng)性的風(fēng)險(xiǎn)顯著增高（OR=1.9，95%CI為0.8～2.5）。見(jiàn)表3。

表3 不同臨床病理參數(shù)乳腺癌患者XPC rs2228000位點(diǎn)基因型分布比較

3 討論

XPC蛋白可與紫外切除修復(fù)蛋白R(shí)AD23B形成異二聚體復(fù)合物[4]，在核苷酸切除修復(fù)（nucleotide excision repair，NER）的早期發(fā)揮作用，是核苷酸切除修復(fù)系統(tǒng)的重要組成部分[5]。有研究結(jié)果顯示，XPC可與人源RAD23B重組蛋白相互作用，形成XPC-RAD23B復(fù)合物，激活p53抑癌基因，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯，并在DNA識(shí)別和NER機(jī)制的啟動(dòng)中發(fā)揮重要作用[6-7]。XPC基因結(jié)構(gòu)功能障礙可導(dǎo)致DNA修復(fù)能力降低，目前已被證實(shí)與肝癌、食管癌、胃癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤的易感性相關(guān)[8-9]。

本研究結(jié)果顯示，乳腺癌組與正常對(duì)照組基因型（CC、CT、TT）和等位基因（C、T）的分布頻率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；攜帶T等位基因的個(gè)體（CT+TT基因型）乳腺癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)是攜帶C等位基因個(gè)體的1.52倍（OR=1.52，95%CI為1.37～1.94），攜帶CT和TT基因型的個(gè)體乳腺癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)分別是攜帶CC基因型個(gè)體的1.36和2.44倍（OR值分別為1.36、2.44，95%CI分別為1.06～1.75、1.64～3.65）。提示XPCrs2228000（Ala499Val）位點(diǎn)多態(tài)性→T變異與乳腺癌發(fā)病有關(guān)。吳茵茵等[10]發(fā)現(xiàn)，XPCrs2228000位點(diǎn)多態(tài)性與乳腺癌發(fā)生無(wú)關(guān)，與本研究結(jié)果不一致。原因可能與地區(qū)、樣本數(shù)量、基因之間遺傳連鎖不平衡和缺少其他腫瘤患者XPCrs2228000位點(diǎn)多態(tài)性研究等有關(guān)。

有研究結(jié)果顯示，XPC基因會(huì)影響不同個(gè)體對(duì)DNA損傷的修復(fù)能力，從而影響患者惡性腫瘤的發(fā)生、激素水平和預(yù)后[11-12]。本研究結(jié)果顯示，XPCrs2228000位點(diǎn)基因型分布與ER陽(yáng)性和病理分型有關(guān)；以其他病理類(lèi)型（浸潤(rùn)性小葉癌、原位癌等）為對(duì)照，CT+TT基因型個(gè)體發(fā)生浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌的風(fēng)險(xiǎn)增高（OR=2.3，95%CI為1.3～4.0），且含等位基因T的個(gè)體所占比例較高（71.7%）。浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌是乳腺癌的常見(jiàn)類(lèi)型，表現(xiàn)為分化程度低，預(yù)后較差[13]。本研究結(jié)果還顯示，XPCrs2228000位點(diǎn)多態(tài)性與年齡、絕經(jīng)狀態(tài)、PR、BRCA1等均無(wú)關(guān)（P>0.05），與文獻(xiàn)報(bào)道[14-15]一致。但因隨訪時(shí)間較短，人群地域分布較集中，可能存在與其他未知功能性SNP之間連鎖不平衡的偏差，本研究結(jié)果可能具有一定的局限性。

綜上所述，XPCrs2228000位點(diǎn)多態(tài)性與乳腺癌發(fā)病有一定關(guān)系。