◎ 黃小龍,馬恩耀,孔 箭,方達鋒,羅文英,周勁松
(廣州采芝林藥業(yè)有限公司,廣東 廣州 510000)
砂仁為藥食兩用中藥材,是姜科植物陽春砂(Amomum villosumLour.)、綠殼砂(Amomum villosumLour.var.xanthioidesT.L.Wu et Senjen) 或 海 南 砂(Amomum longiligulareT.L.Wu)的干燥成熟果實[1]。研究發(fā)現(xiàn),砂仁的主要成分為乙酸龍腦酯、橙花叔醇等[2]。其中,乙酸龍腦酯具有止瀉、鎮(zhèn)痛等功效。陽春砂中乙酸龍腦酯的相對含量為59.60%,是綠殼砂或縮砂的4 倍多,因此陽春砂仁的藥效成分最高,中醫(yī)臨床用藥也以陽春砂仁為主[3]。
陽春砂仁臨床治療效果突出,且為藥食同源藥材,每年市場需求量超2 200 t。陽春砂仁的種植面積逐漸擴大,如云南省陽春砂仁栽培面積由6 500 hm2增至8 613 hm2,約占全國種植總面積的64%[4];再如陽春全市陽春砂仁種植面積由2017 年的逾1 333 hm2到2020 年的2 980 hm2。而在種植過程中農(nóng)藥的使用不可避免,有機氯與有機磷類農(nóng)藥因具有殺蟲廣譜、高效等特點而被廣泛使用,氨基甲酸酯類農(nóng)藥是一種合成農(nóng)藥,作為殺蟲劑、除草劑和殺菌劑,應(yīng)用也十分廣泛[5]。農(nóng)藥殘留定量檢測意義重大。
因為農(nóng)藥殘留的痕量以及基質(zhì)(樣品中被分析物以外的組分)的復(fù)雜性,所以需要通過建立一種快速、準確、高效和靈敏的前處理方法,將農(nóng)藥從基質(zhì)中分離出來?,F(xiàn)代應(yīng)用中農(nóng)藥殘留檢測的前處理技術(shù)主要是超臨界流體萃取和QuEChERS 等技術(shù)。QuEChERS技術(shù)只吸附溶液中的干擾基質(zhì),而對待測目標化合物保留不吸附,該法主要使用的凈化吸附劑有N-丙基乙二胺(Primary Secondary Amine,PSA)、十八烷基硅烷鍵合硅膠(C18)、石墨化碳黑(Graphitized Carbon Blacks,GCB)、氨丙基粉和氧化鋁粉等[6]。本研究建立QuEChERS-氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜農(nóng)藥殘留分析方法,對10 批陽春砂仁藥材進行31 種禁用農(nóng)藥的殘留量的檢測,方法具有良好的靈敏度、準確度和精密度,且線性良好,保證陽春砂仁藥材符合《中國藥典》的要求。
陽春砂仁藥材由廣州白云山中藥飲片有限公司提供,10 批陽春砂仁樣品具體編號以及產(chǎn)地見表1。
表1 10 批陽春砂仁藥材編號產(chǎn)地表
1.2.1 儀器
TGL-20R 醫(yī)用離心機(山東百歐);Raykol-AuToEVA 自動氮吹儀(安譜);8890-7000D 三重四極桿氣質(zhì)聯(lián)用儀(安捷倫);渦旋儀(EOAA-VM-B);Comfort I 超純水機(賽多利斯);數(shù)字可調(diào)型瓶口分液器(BDAND)。
1.2.2 試劑
31 種禁用農(nóng)藥混合對照品溶液(對照品溶液濃度見2020 年版《中國藥典》);磷酸三苯酯;冰醋酸(優(yōu)級純);提取鹽;分散固相萃取凈化管DIKMA;甲酸銨(色譜純);異丙醇(色譜純);乙腈(色譜純);甲醇(色譜純)。
①0.1%甲酸溶液(含5 mol·L-1甲酸銨)的配制。取甲酸銨0.319 5 g,置于1 000 mL 容量瓶中,加入0.1%甲酸溶液至刻度。②乙腈-0.1%甲酸溶液(含5 mol·L-1甲酸銨)(95 ∶5)的配制。取0.1%甲酸溶液(含5 mol·L-1甲酸銨)50 mL,置于1 000 mL 容量瓶中,加入乙腈定容至刻度。③1%冰醋酸溶液的配制。量取冰醋酸10 mL,加入超純水至1 000 mL。
1.4.1 待測農(nóng)藥物質(zhì)及定量限
31 種禁用農(nóng)藥及定量限見表2。
表2 31 種禁用農(nóng)藥定量限表
1.4.2 工作溶液配制
①內(nèi)標溶液的配制。取磷酸三苯酯對照品0.1 mL,精密量取,置于10 mL 容量瓶中,加乙腈溶解并稀釋至刻度。②混合對照品溶液的配制。精密量取31 種農(nóng)藥混合標準溶液0.25 mL,置于10.00 mL 容量瓶中,用乙腈稀釋至刻度,搖勻,即得。③工作溶液的配制。將混合對照品溶液稀釋5 倍,即為工作溶液。④空白基質(zhì)溶液的配制。取空白基質(zhì)樣品,同樣品制備過程制備,作為空白對照曲線。⑤基質(zhì)混合對照溶液的配制。分別精密吸取空白基質(zhì)溶液1.0 mL(6 份),40 ℃氮吹濃縮至約0.4 mL,分別加入工作溶液l0 μL、20 μL、50 μL、l00 μL、150 μL 和200 μL,加乙腈定容至l mL,渦旋混勻,即得。
1.4.3 樣品前處理
取砂仁藥材樣品粉碎過3 號篩,得樣品粉末,精密稱定3 g,置于50 mL 聚苯乙烯具塞離心管中,加入1%冰醋酸溶液15 mL,使用渦旋儀渦旋,使藥粉與溶液充分混合、浸潤,靜置30 min,用移液器精密加入乙腈15 mL,渦旋混勻,置振蕩器上劇烈振蕩(500 次/min)5 min,置于冰箱冷卻10 min,加入提取鹽——無水硫酸鎂與無水硫酸鈉的混合粉末(4 ∶1)7.5 g,立即搖散,再置振蕩器上劇烈振蕩(500 次/min)3 min,離心機離心(5 500 r·min-1)5 min,取上清液9 mL,置預(yù)先裝有凈化材料的分散固相萃取凈化管(無水硫酸鎂900 mg、N-丙基乙二胺300 mg、十八烷基硅烷鍵合硅膠300 mg、硅膠300 mg和石墨化碳黑90 mg)中,渦旋使充分混勻,置振蕩器上劇烈振蕩(500 次/min)5 min 使凈化完全,離心(5 500 r·min-1)5 min,用移液槍精密吸取上清液5 mL,置氮吹儀上40 ℃水浴濃縮至約0.4 mL,加乙腈稀釋定容至1.0 mL,渦旋混勻,過濾膜,取續(xù)濾液,即得樣品溶液。
1.4.4 測定
分別精密吸取基質(zhì)混合對照溶液和供試品溶液各1 mL,精密加入內(nèi)標溶液0.3 mL,混勻,濾過,取續(xù)濾液。分別精密吸取上述兩種溶液各1 μL,注入氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀,按內(nèi)標標準曲線法計算。
1.4.5 儀器條件
(1)氣相色譜條件。氣相色譜柱:VF-17MS(30 m×0.25 mm,0.25 μm);進樣體積1 μL,進樣口為恒壓進樣模式,進樣口溫度250 ℃,不分流進樣;載氣為高純氦氣(He);離子源溫度250 ℃;柱溫250 ℃;柱前壓146 kPa;升溫程序:初始溫度60 ℃,保持1 min,以30 ℃·min-1升至120 ℃,再以10 ℃·min-1的速率升溫至160 ℃,再以2 ℃·min-1的速率升溫至230 ℃,最后以15 ℃·min-1的速率升溫至300 ℃,保持6 min。
(2)質(zhì)譜條件。以三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測;離子源為電子轟擊源(EI),離子源溫度250 ℃;碰撞氣為氮氣;質(zhì)譜傳輸接口溫度250 ℃;質(zhì)譜監(jiān)測模式為多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)。
2.1.1 標準曲線
基質(zhì)混合對照溶液進樣,經(jīng)儀器測量,以基質(zhì)混合對照溶液峰面積/內(nèi)標溶液峰面積為縱坐標,以基質(zhì)混合對照溶液濃度/內(nèi)標溶液濃度為橫坐標繪制標準曲線,農(nóng)藥化合物以S/N≥3 對應(yīng)的質(zhì)量濃度為檢出限,以S/N≥10 對應(yīng)的質(zhì)量濃度為定量限,結(jié)果見表3。31 種農(nóng)藥的相關(guān)系數(shù)為0.985 4 ~0.999 8,線性關(guān)系良好,檢出限為0.000 1 ~0.001 2 mg·kg-1,檢出限低,說明其靈敏度高。
表3 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法下31 種農(nóng)藥的相關(guān)系數(shù)、線性方程、檢出限、定量限表
2.1.2 加標回收率與精密度試驗
向空白樣品基質(zhì)中加入低、中、高3 個水平濃度的混合農(nóng)藥標準溶液,重復(fù)測定3 次,計算回收率及相對標準偏差(RSD),結(jié)果見表4。試驗結(jié)果顯示,31 種農(nóng)藥的加標回收率為62.62%~97.70%,RSD 為0.62%~10.61%,說明方法的準確性和精密度良好,能滿足31 種農(nóng)藥殘留的檢測要求。
表4 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定31 種農(nóng)藥的回收率和RSD 表
2.1.3 重復(fù)性試驗
按照儀器分析條件和樣品前處理方法,精密稱取同一樣品8 份,進行平行實驗,分別計算RSD 值,結(jié)果見表5。試驗結(jié)果表明,RSD 為0.1%~2.9%,均<3.0%,表明該方法重復(fù)性良好。
10 批陽春砂仁樣品制備:各取砂仁樣品粉末(過三號篩)精密稱定3 g,平行兩份,分別為A 樣、B 樣,按樣品前處理方法進行處理。通過氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定陽春產(chǎn)地的10 批砂仁藥材的31 種禁用農(nóng)藥殘留量均為未檢出,表明收集的10 批砂仁藥材質(zhì)量良好,產(chǎn)地種植管理規(guī)范。
QuEChERS 法是一種基于固相萃?。⊿olid Phase Extraction,SPE)的樣品前處理技術(shù),可有效避免液-液分配中出現(xiàn)的乳化現(xiàn)象,減少有機溶劑用量,縮短前處理時間[7]。氣質(zhì)聯(lián)用儀當前已被用于分離、鑒定復(fù)雜組分,其綜合了氣相色譜分辨率高和質(zhì)譜靈敏度高的特點,可定性定量分析藥物與代謝物[8-9]。QuEChERS 方法與固相萃取法、液液萃取法相比,方法操作簡單、使用毒性有機試劑少,可避免固相微萃取法和攪拌棒吸附萃取技術(shù)的高成本、樣品易殘留、纖維性脆等缺點[10]。
QuEChERS 法常以乙酸乙酯、丙酮及甲醇為提取劑提取有效成分。丙酮揮發(fā)性強,分離效果差,回收率較低;乙酸乙酯適用于提取弱極性的化合物;甲醇常作為輔助提取試劑,與乙酸乙酯或其他溶液結(jié)合使用。乙腈是目前使用較多的方法,對多種極性較寬的化合物提取效果好,回收率集中在70%~120%。
基質(zhì)效應(yīng)是由非基體影響的試樣所產(chǎn)生的反應(yīng)數(shù)值增加或降低的一種情況[10]。土壤中的底物作用對土壤中的農(nóng)藥殘留有很大的作用,要徹底去除土壤中的底物作用非常困難。農(nóng)藥殘留含量測定中,由于農(nóng)藥種類繁多,在氣相-串聯(lián)質(zhì)譜中加入磷酸三苯酯,可進一步減少底物的作用。
本實驗運用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定10 批陽春砂仁中31 種禁用農(nóng)藥殘留量。實驗對該方法進行了方法學(xué)驗證,考察了準確度、精密度、檢測限、線性范圍,結(jié)果表明氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法高效、靈敏、穩(wěn)定、簡單、快速、經(jīng)濟,適用于砂仁的農(nóng)藥殘留快速檢測。來自廣東陽春的10 批砂仁藥材中,31 種禁用農(nóng)藥檢測結(jié)果均為未檢出,表明產(chǎn)地種植管理規(guī)范,藥材安全性高。