◎ 王文潔，李 瑩

（譜尼測(cè)試集團(tuán)股份有限公司，湖北 武漢 430000）

食品安全關(guān)系民生，直接影響人們的身心健康和生活質(zhì)量，更是一個(gè)國(guó)家國(guó)民幸福指數(shù)和文明程度的體現(xiàn)[1]。隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，生活條件的不斷提升，人們對(duì)食品安全的要求也不斷提高。我國(guó)的食品安全問(wèn)題包括微生物污染、重金屬污染、農(nóng)藥獸藥殘留以及添加劑的非法使用等，其中，微生物污染是影響我國(guó)食品安全的一個(gè)主要因素，因此微生物檢驗(yàn)是保證食品安全的重要前提[2]。菌落總數(shù)是指食品檢樣經(jīng)過(guò)處理后，在一定條件下（如培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間等）培養(yǎng)后，所得每克（毫升）檢樣中形成的微生物菌落總數(shù)[3]。它是食品微生物檢測(cè)中的重要衛(wèi)生學(xué)指標(biāo)，可直接反映出食品在生產(chǎn)、加工、運(yùn)輸和儲(chǔ)藏等環(huán)節(jié)被微生物污染的情況，在一定程度上標(biāo)志著食品生產(chǎn)過(guò)程中的衛(wèi)生質(zhì)量控制狀況[4-5]。在歷年國(guó)家監(jiān)督抽檢工作中，調(diào)味品、乳制品、肉制品、方便食品、飲料和糕點(diǎn)等多個(gè)食品類別均涉及菌落總數(shù)項(xiàng)目。菌落總數(shù)的增加會(huì)加速食品腐敗變質(zhì)進(jìn)程，使食品失去食用價(jià)值。當(dāng)消費(fèi)者食用了菌落總數(shù)超標(biāo)的食品時(shí)，會(huì)出現(xiàn)各種腸道疾病，甚至嘔吐、發(fā)燒、腹瀉等，身體健康受到嚴(yán)重?fù)p傷[6]。因此，微生物實(shí)驗(yàn)員應(yīng)熟練掌握食品中菌落總數(shù)的檢測(cè)方法及操作要求，為市場(chǎng)監(jiān)督管理評(píng)價(jià)提供準(zhǔn)確有效的數(shù)據(jù)支撐，從而保障消費(fèi)者的權(quán)益[7]。

能力驗(yàn)證是利用實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)，按照預(yù)先制定的準(zhǔn)則確定實(shí)驗(yàn)室或檢測(cè)機(jī)構(gòu)檢測(cè)能力的一種活動(dòng)，也是控制實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)質(zhì)量的重要方式[8-9]。能力驗(yàn)證可幫助實(shí)驗(yàn)室了解自身的檢測(cè)能力，證實(shí)檢測(cè)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，及時(shí)發(fā)現(xiàn)并糾正自身的不足之處，總結(jié)經(jīng)驗(yàn)指導(dǎo)日常的檢測(cè)工作[10-11]。為驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)室是否具備檢測(cè)菌落總數(shù)的技術(shù)能力，確保檢測(cè)結(jié)果的可靠性，實(shí)驗(yàn)室參加了由中國(guó)檢科院測(cè)試評(píng)價(jià)中心組織的ACASPT1081 食品中菌落總數(shù)檢驗(yàn)?zāi)芰︱?yàn)證項(xiàng)目，采用《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)檢驗(yàn)》（GB 4789.2—2016）的方法對(duì)2 份樣品進(jìn)行檢驗(yàn)，分析總結(jié)能力驗(yàn)證試驗(yàn)過(guò)程及結(jié)果，以期為菌落總數(shù)相關(guān)檢測(cè)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源

實(shí)驗(yàn)室收到2 份中國(guó)檢科院測(cè)試評(píng)價(jià)中心組織的ACAS-PT1081 食品中菌落總數(shù)檢驗(yàn)?zāi)芰︱?yàn)證發(fā)放的待測(cè)樣品，樣品編號(hào)分別為21-A560 和21-D485。2 份樣品均為西林瓶真空包裝的白色凍干塊狀人工污染食品。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

平板計(jì)數(shù)瓊脂（Plate Count Agar，PCA）和1% 2,3,5-三苯基氯化四氮唑（2,3,5-trihenylterzoliumchloride，TTC）溶液均采購(gòu)自北京路橋技術(shù)股份有限公司，氯化鈉（Sodium Chloride，SC）購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

恒溫恒濕培養(yǎng)箱（BSC-400，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）；蒸汽滅菌器（SX-700，日本TOMY）；生物安全柜（BSC-1604 ⅡA2，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 樣品前處理

在生物安全柜內(nèi)開(kāi)啟西林瓶，立即加入5 mL 0.85%無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行再水化，待樣品充分溶解后，吸出至無(wú)菌瓶中，再用余下的55 mL 0.85%無(wú)菌生理鹽水清洗西林瓶?jī)?nèi)壁，回收清洗液于上述無(wú)菌瓶中，混勻，此溶液即為待測(cè)樣品原液。

1.4.2 樣品稀釋

充分混勻待測(cè)樣品原液，吸取1 mL 原液于9 mL 0.85%無(wú)菌生理鹽水中，制成1 ∶10 的樣品勻液。使用渦旋混合器充分混勻1 ∶10 的樣品勻液，吸取1 mL 1 ∶10 的樣品勻液于9 mL 0.85%無(wú)菌生理鹽水中，制成1 ∶100 的樣品勻液。依次類推，逐級(jí)進(jìn)行10 倍系列稀釋，獲得10-5～100的樣品稀釋液。在進(jìn)行10 倍遞增稀釋時(shí)，同時(shí)吸取1 mL 樣品勻液于無(wú)菌平皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度做2 個(gè)平皿。試驗(yàn)過(guò)程中設(shè)置兩種對(duì)照，分別為培養(yǎng)基空白對(duì)照和稀釋液空白對(duì)照，每個(gè)對(duì)照做2 個(gè)平皿。

1.4.3 培養(yǎng)計(jì)數(shù)

待PCA 培養(yǎng)基冷卻至46 ℃左右，向其中加入1% TTC 溶液，使TTC 終濃度為0.001%[12]。分別將15 ～20 mL 不 含TTC 的PCA 和 含0.001% TTC 的PCA 培養(yǎng)基傾注平皿中，轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使其混合均勻。待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板，（36±1）℃培養(yǎng)（48±2）h。依據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)檢驗(yàn)》（GB 4789.2—2016）的方法對(duì)菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品測(cè)試結(jié)果分析

由表1 可知，菌落計(jì)數(shù)結(jié)果與稀釋度倍數(shù)成反比，且同一稀釋度平行樣品間差異較小，表明實(shí)驗(yàn)結(jié)果相對(duì)準(zhǔn)確。空白對(duì)照無(wú)菌落生長(zhǎng)，表明實(shí)驗(yàn)過(guò)程無(wú)污染，實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效。

表1 樣品測(cè)試結(jié)果表

重復(fù)性試驗(yàn)是使用相同方法，在同一實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)同一種物質(zhì)，由同一操作者使用同一設(shè)備在短時(shí)間內(nèi)的兩次獨(dú)立的單次實(shí)驗(yàn)試驗(yàn)結(jié)果的絕對(duì)差值，不應(yīng)大于重復(fù)性限，r=0.25，以10 為底的每毫升中微生物計(jì)數(shù)的對(duì)數(shù)[13-14]。樣品21-A560 和21-D485 在10-1稀釋度的平板符合30 ～300 CFU 計(jì)數(shù)要求，在100稀釋度的平板上的菌落總數(shù)超過(guò)300 CFU，計(jì)為“多不可計(jì)”。在不加TTC 的情況下，由人員B 可知，21-A560 的第1 次和第2 次試驗(yàn)結(jié)果分別為9.0×102CFU·mL-1和9.1×102CFU·mL-1，21-D485 的2 次試驗(yàn)結(jié)果均為1.6×103CFU·mL-1，2 個(gè)樣品的2 次試驗(yàn)結(jié)果的對(duì)數(shù)值絕對(duì)差值均為0.005，小于0.25，檢測(cè)結(jié)果滿足重復(fù)性要求。

復(fù)現(xiàn)性是指用同一方法檢測(cè)同一樣品，在不同實(shí)驗(yàn)室由不同操作者使用不同設(shè)備得到的兩個(gè)單次實(shí)驗(yàn)結(jié)果之間的絕對(duì)差值，不大于復(fù)現(xiàn)性限，R=0.45，以10 為底的每毫升中微生物計(jì)數(shù)的對(duì)數(shù)[13-14]。當(dāng)TTC 終濃度為0%時(shí)，由第1 次試驗(yàn)可知，對(duì)于21-A560，人員A 和人員B 的試驗(yàn)結(jié)果分別為1.1×103CFU·mL-1和9.0×102CFU·mL-1，兩人試驗(yàn)結(jié)果的對(duì)數(shù)值的絕對(duì)差值為0.085；對(duì)于21-D485，人員A 和人員B 的試驗(yàn)結(jié)果分別為1.7×103CFU·mL-1和1.6×103CFU·mL-1，兩人試驗(yàn)結(jié)果的對(duì)數(shù)值的絕對(duì)差值為0.025，均小于0.45，檢測(cè)結(jié)果滿足復(fù)現(xiàn)性要求。

在日常檢測(cè)中，一些固體樣品如餅干、糕點(diǎn)等殘?jiān)跓o(wú)菌生理鹽水中不能完全溶解，在培養(yǎng)基上會(huì)被誤讀為菌落，導(dǎo)致計(jì)數(shù)結(jié)果錯(cuò)誤，研究發(fā)現(xiàn)TTC 的應(yīng)用可解決這一難題[15]。TTC 溶于水是無(wú)色的，嗜中溫性需氧菌在新陳代謝過(guò)程中產(chǎn)生的琥珀脫氫酶可使無(wú)色的TTC 還原成紅色的三苯基甲臜（TPF），使菌落顯紅色，從而區(qū)分樣品顆粒和菌落[16-17]。由表1 可知，TTC 的添加濃度為0%和0.001%時(shí)，人員A 對(duì)樣品21-A560 的檢測(cè)結(jié)果分別為1.1×103CFU·mL-1和8.4×102CFU·mL-1，對(duì)數(shù)值分別為3.039 和2.924，差值為0.115。對(duì)樣品21-D485 的檢測(cè)結(jié)果分別為1.7×103CFU·mL-1和1.5×103CFU·mL-1，對(duì) 數(shù) 值 分別為3.230 和3.179，差值為0.051。對(duì)于同一樣品，含有0%和0.001% TTC 的菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值的差值均小于0.25。由此可知，TTC 終濃度為0.001% 時(shí)，對(duì)菌落總數(shù)檢測(cè)無(wú)影響，這與葉超等[18]的研究發(fā)現(xiàn)一致。

2.2 能力驗(yàn)證結(jié)果分析

能力驗(yàn)證評(píng)價(jià)結(jié)果如表2 所示，能力評(píng)價(jià)準(zhǔn)則為|Z|≤2.0 時(shí)，結(jié)果為滿意；當(dāng)2.0 ＜|Z|＜3.0 時(shí)，結(jié)果可疑；|Z|≥3.0 時(shí)，結(jié)果不滿意。樣品21-A560 的|Z|值為-0.8，21-D485 的|Z|值為-1.6，兩者均＜2.0，能力評(píng)價(jià)結(jié)果為滿意。其中，21-D485 的|Z|值偏低，可能是由兩方面的原因造成的。①培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，本次試驗(yàn)的培養(yǎng)時(shí)間為48 h，計(jì)數(shù)時(shí)發(fā)現(xiàn)有部分菌落被覆蓋，導(dǎo)致計(jì)數(shù)結(jié)果偏小。②未對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行覆層，計(jì)數(shù)時(shí)發(fā)現(xiàn)菌落存在彌漫生長(zhǎng)的現(xiàn)象，影響計(jì)數(shù)結(jié)果準(zhǔn)確性。

表2 能力驗(yàn)證評(píng)價(jià)結(jié)果表

3 結(jié)論與討論

本次能力驗(yàn)證中，2 個(gè)樣品的|Z|值均小于2.0，結(jié)果為滿意。通過(guò)此次能力驗(yàn)證試驗(yàn)，分析了以下幾個(gè)關(guān)鍵控制點(diǎn)，以便指導(dǎo)日常檢測(cè)工作。①收到能力驗(yàn)證樣品后，首先檢查樣品是否存在破損、污染、密封性不強(qiáng)等問(wèn)題，如發(fā)現(xiàn)問(wèn)題及時(shí)與機(jī)構(gòu)聯(lián)系。若不能及時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)，需按照作業(yè)指導(dǎo)書(shū)中的要求儲(chǔ)存樣品。②菌落總數(shù)測(cè)定為定量試驗(yàn)，儀器設(shè)備會(huì)直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此，試驗(yàn)所用設(shè)備應(yīng)定期進(jìn)行檢定、校準(zhǔn)和維護(hù)，減小設(shè)備誤差。③日常需做好試劑耗材的驗(yàn)收工作，在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中，需保證所用培養(yǎng)基、試劑、耗材的無(wú)菌狀態(tài)。④微生物繁殖速度非?？?，一般20 ～30 min 即可繁殖一代，因此試驗(yàn)過(guò)程需將操作時(shí)間控制在15 min 左右。⑤兩個(gè)樣品應(yīng)獨(dú)立進(jìn)行試驗(yàn)，防止樣品交叉污染，保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。⑥在進(jìn)行梯度稀釋時(shí)，每遞增稀釋一次，需換用1 次1 mL無(wú)菌槍頭。槍頭外面沾有高稀釋度的樣液，因此槍頭不能碰到下一稀釋度的液面和試管壁，避免下一稀釋度的菌落數(shù)量偏高。此外，試驗(yàn)應(yīng)多做幾個(gè)稀釋度，確保有適宜計(jì)數(shù)的平板。⑦TTC 可使菌落顯紅色，便于區(qū)分菌落和雜質(zhì)，同時(shí)可抑制某些革蘭氏陽(yáng)性菌生長(zhǎng)，防止菌落蔓延[12]。在檢測(cè)工作中，可在培養(yǎng)基中加入適宜濃度的TTC，但TTC 對(duì)溫度比較敏感，加入TTC 時(shí)需注意培養(yǎng)基的溫度。⑧傾注平皿時(shí)，培養(yǎng)基溫度需適宜。若溫度過(guò)高，培養(yǎng)基內(nèi)的水分蒸發(fā)到皿蓋上，經(jīng)冷凝會(huì)滴落在培養(yǎng)基上，不利于單菌落的形成。同時(shí)，溫度高會(huì)滅活樣品中的菌落，造成計(jì)數(shù)結(jié)果偏低。若溫度過(guò)低，培養(yǎng)基會(huì)凝固成塊造成樣品分散不均勻，影響結(jié)果準(zhǔn)確性。⑨如果樣品中可能含有在瓊脂培養(yǎng)基表面彌漫生長(zhǎng)的菌落時(shí)，可在凝固后的瓊脂表面覆蓋一薄層瓊脂培養(yǎng)基，避免菌落蔓延。⑩在培養(yǎng)期間，可提前24 h 觀察平板現(xiàn)象并進(jìn)行第一次菌落計(jì)數(shù)，避免因培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)造成菌落被覆蓋，或生長(zhǎng)過(guò)快連到一起的情況。?試驗(yàn)過(guò)程可分別設(shè)置培養(yǎng)基空白對(duì)照和生理鹽水空白對(duì)照。當(dāng)生理鹽水空白對(duì)照無(wú)菌生長(zhǎng)時(shí)，則證明生理鹽水和培養(yǎng)基均無(wú)問(wèn)題。當(dāng)生理鹽水空白對(duì)照有菌生長(zhǎng)，但培養(yǎng)基空白對(duì)照無(wú)菌生長(zhǎng)時(shí)，推斷生理鹽水存在問(wèn)題。 ? 試驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)在生物安全柜中放置敞開(kāi)的營(yíng)養(yǎng)瓊脂和孟加拉紅瓊脂平板，監(jiān)測(cè)試驗(yàn)過(guò)程是否有細(xì)菌或霉菌的污染。?整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程需在生物安全柜中進(jìn)行，防止樣液外溢，避免操作人員被感染。操作結(jié)束后，對(duì)生物安全柜進(jìn)行滅菌，且將培養(yǎng)物進(jìn)行無(wú)害化處理，避免污染環(huán)境。

本次能力驗(yàn)證證實(shí)了實(shí)驗(yàn)室對(duì)菌落總數(shù)的檢測(cè)能力，提升了檢驗(yàn)人員的技術(shù)水平，增強(qiáng)了客戶對(duì)實(shí)驗(yàn)室的信任度，為擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)室核心競(jìng)爭(zhēng)力奠定了基礎(chǔ)。但本次實(shí)驗(yàn)也存在一些不足之處，實(shí)驗(yàn)室僅采用了平板法對(duì)菌落總數(shù)進(jìn)行檢測(cè)，在日后的工作中可考慮將菌落測(cè)試片法作為檢測(cè)輔助手段，兩種方法相互驗(yàn)證，以保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，提高實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)質(zhì)量。