◎ 華 艷，覃麗霞

（1.廣西壯族自治區(qū)特種設(shè)備檢驗研究院，廣西 南寧 530000；2.廣西壯族自治區(qū)產(chǎn)品質(zhì)量檢驗研究院，廣西 南寧 530000）

茶黃素具有良好的抗氧化、抗炎、防癌抗癌、降脂和預(yù)防心血管疾病的功效，是紅茶品質(zhì)優(yōu)劣的重要指標(biāo)，準(zhǔn)確測定紅茶中茶黃素的含量可有效指導(dǎo)紅茶科學(xué)生產(chǎn)。1957 年，Roberts 首次發(fā)現(xiàn)茶黃素（Theaflavins），并提出了茶黃素的定量測定方法，即分光光度法[1]。茶黃素是一類溶于乙酸乙酯的橙黃色物質(zhì)，是由茶多酚及其衍生物氧化形成的具有多個羥基或酚羥基的苯并卓酚酮結(jié)構(gòu)的化合物[2]。目前，已發(fā)現(xiàn)茶黃素的種類達(dá)20 多種，但含量較高且進(jìn)行深入研究的成分主要有茶黃素（Theaflavin，TF）、茶黃素-3-沒食子酸酯（Theaflavin-3-Gallate，TF-3-G）、茶黃素-3'-沒食子酸酯（TF-3'-G）和茶黃素-3,3'-雙沒食子酸酯（Theaflavin 3,3'-Digallate，TFDG）4 種[3]。

茶黃素的測定方法有Robert 法、α-氨基乙基二苯硼酸酯（Flavognost）法、Sepha-dex LH-20 柱色譜法和氣相色譜法和高效液相色譜法等[4]。由于Robert法和Flavognost 法受到多種因素的影響，測定結(jié)果偏差大；Sepha-dex LH-20 柱色譜法操作復(fù)雜；氣相色譜法需要用衍生化法對茶黃素進(jìn)行分析，該法煩瑣，在茶黃素的分析中使用不多[5]。而高效液相色譜法較為成熟，具有較高的靈敏度和精確度，可以快速、準(zhǔn)確地測定紅茶中的茶黃素。因此，本文采用高效液相色譜法對8 種紅茶中的茶黃素含量進(jìn)行測定，分析紅茶中茶黃素的含量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

8 種紅茶樣品有滇紅、祁門工夫、川紅工夫、祁紅毛峰、黃金茶紅茶、正山小種紅茶、寧紅工夫和宜紅工夫；TF、TF-3-G、TF-3'-G 和TFDG 標(biāo)準(zhǔn)品，純度均大于98%（上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司）；乙腈（色譜純，德國默克公司）；冰乙酸（色譜純，阿拉丁試劑有限公司）；甲醇（分析純，北京化工廠）；乙酸乙酯（分析純，天津市化學(xué)試劑一廠）；水為Milli-Q 超純水。

1.2 儀器設(shè)備

1260 高效液相色譜儀和DAD 檢測器（美國安捷倫公司）；BP211D 型電子精密天平（德國賽多利天平有限公司）；Allegra 64R 臺式冷凍高速離心機(jī)（美國Beckman Coulter 公司）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇水北科普實驗儀器廠）。

1.3 實驗方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

分別精密稱取4 類茶黃素標(biāo)準(zhǔn)品25 mg 于25 mL容量瓶中，用甲醇定容得到1 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。取1 mL 標(biāo)準(zhǔn)儲備液置于5 mL 容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)為20%的甲醇溶液定容，得200 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1 mL、0.5 mL、2.5 mL、5.0 mL、10.0 mL，用甲醇水溶液定容至10.0 mL 的容量瓶中，稀釋成質(zhì)量濃度為2 μg·mL-1、10 μg·mL-1、50 μg·mL-1、100 μg·mL-1和200 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液。

1.3.2 樣品溶液的制備

稱取均勻磨碎的8 種紅茶樣品1 g（精確至0.001 g）加入20 mL 體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇溶液，通過恒溫水浴鍋70 ℃浸提10 min，再使用冷凍高速離心機(jī)離心10 min，取上清液于50 mL 容量瓶中。殘渣操作步驟同上，最后合并加70%甲醇定容，制得待測樣品。每個樣品重復(fù)3 次，外標(biāo)法分析計算8 種茶樣中TF、TF-3-G、TF-3'-G 和TFDG 的含量。

1.3.3 色譜條件

根據(jù)《茶葉中茶黃素的測定 高效液相色譜法》（GB/T 30483—2013），色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）； 流 動 相 為2%乙酸水溶液（A）和乙腈+乙酸乙酯（B）；流速為1.0 mL·min-1；柱溫30 ℃，檢測波長為280 nm，進(jìn)樣量10 μL；采用梯度洗脫，流動相B 在0 ～15 min時0%→20%，15 ～25 min 時20%→30%，并保持5 min，在30 min 時30%→20%，維持10 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動相條件的優(yōu)化

紅茶中茶黃素的測定多采用乙腈-2%乙酸水溶液為流動相，因此采用乙腈-2%乙酸水溶液作溶劑系統(tǒng)，4 種茶黃素類物質(zhì)只有TF-3-G、TF-3'-G 實現(xiàn)分離，TF、TFDG 無法分離，通過改變洗脫梯度程序可以分離，但不能滿足快速分離的要求。此方法色譜圖峰型差、拖尾嚴(yán)重、分離效果差，不利于定量計算。通過加入一定量的乙酸乙酯，明顯改善了分離效果，峰型尖銳、不拖尾，縮短了檢測時間。但由于樣品中雜質(zhì)峰較多，為了使茶黃素類物質(zhì)與雜質(zhì)可以有效分離，經(jīng)多次優(yōu)化梯度洗脫程序，乙腈+乙酸乙酯的體積分?jǐn)?shù)在10 min 內(nèi)由20%增加到30%，整個分析過程為40 min，4 種茶黃素類物質(zhì)實現(xiàn)分離。

2.2 色譜柱的選擇

選擇Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱，由于該色譜柱可以承受較低pH 值的流動相，pH 值為1 ～8。當(dāng)流動相的pH 值在2 左右時分析樣品，不僅可以保證色譜柱無損壞，同時具有良好的分離度和峰型。

2.3 檢測波長的確定

通過DAD 檢測器進(jìn)行光譜掃描發(fā)現(xiàn)，4 種茶黃素類物質(zhì)在260 ～280 nm、360 ～380 nm 和450 ～470 nm均有吸收峰，最大吸收值在波長280 nm 左右，故選擇280 nm 作為檢測波長。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限

按照色譜條件對配制好的2 ～200 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，分別以質(zhì)量濃度和峰面積為橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程。各物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R2＞0.999，質(zhì)量濃度與峰面積具有良好的線性相關(guān)性。將最低濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，按照S/N=3 計算得出方法的檢出限，按照S/N=10 計算得出方法的定量限，結(jié)果如表1 所示。

表1 線性范圍、檢出限和定量限結(jié)果表

2.5 精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性實驗

精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性是高效液相色譜法的重要衡量指標(biāo)。在1.3.3 的色譜條件下，按1.3.1 方法制備標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進(jìn)樣5 次，根據(jù)4 種茶黃素類物質(zhì)的峰面積，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），得出精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性分別為2.4%～3.5%、1.98%～4.76%、2.28%～3.91%，見圖1。表明該方法可以穩(wěn)定、準(zhǔn)確檢測出樣品中的4 種茶黃素類物質(zhì)，具有良好的精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性。

圖1 高效液相色譜法的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性驗證結(jié)果圖

2.6 加標(biāo)回收實驗

向樣品中加入低、中、高3 個濃度水平的茶黃素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行加標(biāo)實驗，按色譜條件進(jìn)行測定，每份樣品進(jìn)行5 次平行測定，計算不同濃度水平樣品的加標(biāo)回收率和RSD，結(jié)果見表2。在3 個加標(biāo)水平下，平均加標(biāo)回收率為96.05%～105.02%，RSD 為1.39%～2.28%，結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確度高。

表2 加標(biāo)回收率實驗結(jié)果表（n=5）

2.7 樣品測定

制備8 種紅茶供試樣品，采用建立的分析方法測定茶黃素含量，結(jié)果見表3。樣品中黃金茶紅茶的茶黃素總含量最高，正山小種紅茶最低。不同品種紅茶中茶黃素總量存在差別，本次測定的8 種紅茶樣品的茶黃素總含量在0.56%～0.82%，平均總含量為0.70%。其中，TFDG 在所有茶黃素類物質(zhì)中含量最高，平均含量達(dá)到0.41%，最高含量達(dá)到0.51%，明顯高于其他3 種茶黃素。

表3 8 種紅茶樣品中茶黃素含量測定結(jié)果表

3 結(jié)論與討論

紅茶中的茶黃素類物質(zhì)有多種，由于樣本和含量限制，本文對流動相條件進(jìn)行了優(yōu)化，建立了適用于4 種茶黃素類物質(zhì)含量測定的高效液相色譜法。通過一系列方法學(xué)驗證，證明該方法線性和精密度良好，準(zhǔn)確度高，可作為檢測紅茶制品的重要依據(jù)。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，8 種紅茶樣品中4 種茶黃素類物質(zhì)總含量在0.56%～0.82%，平均總含量為0.70%。其中，黃金茶紅茶的4 種茶黃素類物質(zhì)含量最高，正山小種紅茶的4 種茶黃素類物質(zhì)含量最低。結(jié)果表明高效液相色譜法可以快速準(zhǔn)確地檢測紅茶中4 種茶黃素類物質(zhì)的含量，更好地促進(jìn)紅茶品質(zhì)的研究發(fā)展。而隨著茶黃素研究的不斷深入，將來會朝著高效液相色譜法為主的多種技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用方向發(fā)展。