◎ 楊丹妮，鄒雨虹

（常州市食品藥品纖維質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，江蘇 常州 213000）

水果蔬菜中富含人體必需的維生素、有機(jī)酸、無機(jī)鹽和植物纖維等營養(yǎng)成分，而即食生鮮果蔬食品因食用方便、口味清新和味道鮮美，更是人們?nèi)粘Ｉ钪泻筒妥郎铣Ｒ姷氖澄?。但是，生鮮果蔬食品僅經(jīng)簡單清洗，未經(jīng)高溫殺菌處理，其表面和內(nèi)部附著的微生物對(duì)其食用安全性造成了極大的隱患[1-2]。因此，如何做好即食生鮮果蔬中病原性微生物檢測成為食品安全領(lǐng)域關(guān)注的一個(gè)重要課題。

目前即食生鮮果蔬中致病菌檢測的方法主要有分離培養(yǎng)[3]、生化鑒定[4]、酶聯(lián)免疫吸附[5]、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[6]和基因芯片法[7]等。常規(guī)方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，既增加了企業(yè)的成本，也加大了政府對(duì)于食品安全的監(jiān)管難度，還無法滿足致病病毒和細(xì)菌的同時(shí)檢測。熒光定量PCR 法在一定程度上彌補(bǔ)了傳統(tǒng)方法的部分不足，但受其熒光通道的限制，在樣本量大、檢測指標(biāo)多的情況下，大大增加工作量。因此，急需一種操作簡單、結(jié)果直觀、單次反應(yīng)可滿足多指標(biāo)篩檢要求的方法來對(duì)即食果蔬中的多種致病微生物進(jìn)行同時(shí)篩檢。

膜芯片法利用反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)（Reverse Dot Blot Hybridization，RDBH）將待測靶標(biāo)基因中的特異性序列作為探針固定在尼龍膜上，同時(shí)利用多對(duì)帶生物素標(biāo)記的引物對(duì)待測靶標(biāo)基因進(jìn)行擴(kuò)增，通過酶-底物顯色，產(chǎn)生肉眼可辨的信號(hào)，具有快速、簡便、高效、直觀等特點(diǎn)。同時(shí)結(jié)合多重PCR 技術(shù)，雙重反應(yīng)體系確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，單次反應(yīng)可同時(shí)篩檢數(shù)十種指標(biāo)[8]。本研究擬在PCR-膜芯片技術(shù)的基礎(chǔ)上，建立包括沙門氏菌（Salmonella）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸埃希氏菌O157:H7（Escherichia coliO157:H7）、單核增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）、輪狀病毒（Rotavirus，RV）、諾如病毒（Norovirus，NV）GI 型和GII 型在內(nèi)的7 種食源性致病微生物的快速篩查方法。

1 材料與方法

1.1 樣品、標(biāo)準(zhǔn)菌及病毒樣本

市場樣品共14份，均購自常州市各大流通環(huán)節(jié)市場。

沙門氏菌（21513）、大腸埃希氏菌O157:H7（21530）、金黃色葡萄球菌（10384）、單核增生李斯特氏菌（21633）、阪崎腸桿菌（21544）、志賀氏菌（21535）、霍亂弧菌（23794）、副溶血性弧菌（21617）、蠟樣芽孢桿菌（21261）和創(chuàng)傷弧菌（21615）等均購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。輪狀病毒（BDS-IQC-072）、諾如病毒（BDS-IQC-226）核酸質(zhì)控品購自廣州邦德盛生物科技有限公司。

1.2 主要試劑

細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒（DP302）、病毒基因組DNA/RNA 提取試劑盒（DP315）購自天根生化科技（北京）有限公司；膜芯片檢測試劑盒，由四川華漢三創(chuàng)生物科技有限公司提供；PCR 引物及探針，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成并純化。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 PCR 引物及探針設(shè)計(jì)

根據(jù)所查文獻(xiàn)、生物信息學(xué)分析并結(jié)合實(shí)驗(yàn)測試結(jié)果，最終選取了具體對(duì)應(yīng)的特異性基因，詳細(xì)信息見表1。

表1 多重PCR 引物、探針信息表

1.3.2 樣品處理與DNA 提取

無菌條件下迅速稱取待檢樣品20 g，并平均分為等質(zhì)量的兩份（每份10 g）。

（1）細(xì)菌前增菌。取待檢樣品加入100 mL 共增菌培養(yǎng)基中。在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中35 ℃、150 r·min-1培養(yǎng)24 h后取出培養(yǎng)基，靜置3～5 min后，取1～3 mL增菌液至一滅菌EP 管中，12 000 r·min-1離心2 min，棄上清留沉淀進(jìn)行細(xì)菌基因組DNA 提取。

（2）病毒富集。參考GB 4789.42—2016 軟質(zhì)水果和生食蔬菜中諾如病毒富集方法進(jìn)行病毒的富集，并用于病毒RNA 提取。

（3）細(xì)菌、病毒基因組DNA/RNA 提取及質(zhì)量測定。進(jìn)行細(xì)菌、病毒基因組DNA/RNA 提取，提取后的基因組DNA 用Nanodrop 2000 測定質(zhì)量，一般要求核酸濃度在20 ng·μL-1以上，A260/A280介于1.8 ～2.0。

1.3.3 PCR 擴(kuò)增

以待測樣品DNA 為模板，依次加入多重PCR Buffer10 μL、EnzymeMix 0.45 μL、Hela cell total RNA 1 μL、樣品總核酸2 ～5 μL，最后用ddH2O 補(bǔ)足20 μL體系。

PCR 擴(kuò)增程序：反轉(zhuǎn)錄45 ℃，30 min；95 ℃，2 min；95 ℃，30 s，55 ℃，30 s，72 ℃，30 s，35 cycles；72 ℃延伸5 min；12 ℃保溫。擴(kuò)增結(jié)束后，即可得到多重PCR 產(chǎn)物。

1.3.4 膜芯片制備

將尼龍膜裁成1.1 cm×1.1 cm 的膜條，放置于雙蒸水中浸泡15 min，用15×SSC 浸泡15 min，取出后放在濾紙上80 ℃烘干，待膜條降至室溫后，按膜芯片探針布局圖（圖1）上順序依次點(diǎn)上內(nèi)參探針（10 ～20 μmol·L-1）、各檢測靶標(biāo)探針（10 ～20 μmol·L-1）、陽性探針PC（5 μmol·L-1）以及陰性探針NC（5 μmol·L-1）。

圖1 膜芯片探針布局圖

1.3.5 雜交顯色將多重PCR 產(chǎn)物置于95 ℃加熱5 min 使其解鏈，立即取出低溫放置，完成雜交反應(yīng)。

1.3.6 結(jié)果判讀

雜交反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)照膜芯片點(diǎn)陣圖判讀檢測結(jié)果，膜芯片探針布局圖如圖1 所示。結(jié)果有效前提：芯片上陽性質(zhì)控點(diǎn)（Positive）顯色，陰性質(zhì)控點(diǎn)（Negative）不顯色。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性測試

陽性模板取1.1 中所述的7 種陽性樣本，按照1.3進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，檢測體系特異性。檢測結(jié)果如圖2所示，各陽性核酸檢測結(jié)果靶標(biāo)點(diǎn)單一且特異，各陰性核酸無陽性探針點(diǎn)顯色，充分證明了該體系具有良好的特異性。

圖2 膜芯片特異性測試芯片結(jié)果圖

2.2 檢出限測試

采 用1.1 中 的7 種 濃 度 為1.0×107copies/mL 的陽性樣本再進(jìn)行2 個(gè)梯度稀釋后檢測多重體系的檢測限，各梯度核酸加樣量為2 μL。如圖3 ～4 所示，通過肉眼觀察結(jié)合儀器信號(hào)值判斷，結(jié)果表明使用陽性樣本進(jìn)行檢測，綜合檢測限可達(dá)1.0×105copies/mL。檢出限以上的樣本，包括混合樣本均能檢測到所有陽性靶點(diǎn)。

圖3 1.0×106 copies/mL 陽性樣本測試結(jié)果圖

圖4 1.0×105 copies/mL 陽性樣本測試結(jié)果圖

2.3 樣本測試

2.3.1 市場樣本測試

收集市場上各種即食蔬菜、水果等，提取相應(yīng)樣本中的核酸，使用已建立的多重PCR 檢測體系進(jìn)行測試，驗(yàn)證體系的可應(yīng)用性。檢測結(jié)果如圖5 所示。

圖5 樣本應(yīng)用性評(píng)價(jià)測試結(jié)果圖

2.3.2 模擬檢測

選取鮮切蘋果作為樣品采用人工添加標(biāo)準(zhǔn)樣品的形式進(jìn)行模擬檢測實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證體系的可應(yīng)用性。取沙門氏菌、大腸埃希氏菌O157、金黃色葡萄球菌、單核增生李斯特氏菌劃線平皿上的單菌落，接種至液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，梯度稀釋至10-7～10-8（約稀釋至1 000 CFU·mL-1），分別取100 μL 接種至100 mL 共增菌培養(yǎng)基中。病毒核酸質(zhì)控品：向病毒富集體系中加入臨界濃度的病毒質(zhì)控品樣本。后續(xù)同上述樣本處理步驟，檢測結(jié)果如圖6 所示，結(jié)果均與預(yù)期相符，證明了體系具有良好的可應(yīng)用性。

圖6 模擬檢測結(jié)果芯片圖

3 結(jié)論

水果蔬菜作為健康飲食的重要組成部分，其消費(fèi)量逐年上升[9]。近年來，即食果蔬食品越來越受消費(fèi)者的青睞。即食果蔬在食用前會(huì)經(jīng)過清洗、消毒、切割、分裝等諸多加工處理環(huán)節(jié)，容易發(fā)生微生物污染。全世界范圍內(nèi)由即食果蔬致病微生物引起的食源性疾病事件頻發(fā)[10-11]。本研究通過對(duì)膜芯片體系檢測特異性和檢出限的測試，充分說明該技術(shù)具有穩(wěn)定性高、特異性強(qiáng)、靈敏度高的特點(diǎn)。既提高了檢測通量，也提高了檢測效率，為食品安全預(yù)防監(jiān)控、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估等提供了一種新型、快速、有效的檢測手段。