王 凝，蘭朝華，廖大龍，李林蔓，向元琳，祝 輝

（四川輕化工大學(xué)生物工程學(xué)院，四川宜賓 644000）

0 引言

藏茶屬于黑茶的一種，距今已有上千年的歷史[1]。藏茶的歷史可以追溯到唐宋茶馬交易的中早期，因產(chǎn)自雅安，唐宋以來暢銷藏區(qū)而得名[2]。我國的黑茶發(fā)源于四川雅安，是我國藏族同胞的主要飲品之一，還被稱為藏族同胞的生命之茶[3]。研究表明，藏茶中含有許多對人體有益的物質(zhì)，具有降血壓、降血脂、降膽固醇和血糖、提高機(jī)體免疫能力、抗輻射、抗氧化、調(diào)節(jié)消化酶活性、潤腸通便、減肥降脂等保健功能[4-6]。

藏茶是經(jīng)殺青、揉捻、渥堆、干燥、精制、拼配、蒸壓等特定工藝制成的黑茶類產(chǎn)品[7]。渥堆工藝是藏茶加工過程中的重要工序[8]，藏茶發(fā)酵是經(jīng)過獨(dú)特的多次渥堆、反復(fù)揉捻等制作工藝，促進(jìn)茶葉多酚類物質(zhì)充分氧化、聚合，使藏茶風(fēng)味獨(dú)特，成為西藏和周邊藏民聚集區(qū)的主要茶葉飲品。渥堆是藏茶品質(zhì)形成中的關(guān)鍵工序，渥堆過程中微生物大量繁殖并分泌胞外酶，通過代謝途徑改變茶葉中成分的組成，從而形成藏茶的特有品質(zhì)[9]。藏茶作為一種后發(fā)酵茶在經(jīng)過漫長的渥堆發(fā)酵后，產(chǎn)生了豐富的微生物類群，不同微生物在藏茶發(fā)酵過程中的動態(tài)變化對藏茶的品質(zhì)起到重要的作用[10]，但目前關(guān)于藏茶渥堆發(fā)酵過程中生物活性變化還有待進(jìn)一步探究。

選用發(fā)酵前、中、后期的藏茶進(jìn)行小鼠灌胃試驗，探究其對抗氧化能力和對腸道功能的影響。通過小鼠肝臟組織測定T-AOC、SOD 活性，以及MDA含量及相關(guān)抗氧化基因等，檢測不同時期藏茶抗氧化能力的影響。通過測定小鼠腸道免疫相關(guān)基因和腸道益生菌的菌群數(shù)量來比較不同發(fā)酵時期藏茶對于小鼠免疫功能的影響，進(jìn)而探究藏茶制作過程中生物學(xué)活性變化規(guī)律，為藏茶的開發(fā)與利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藏茶水提物的制備

試驗所選用藏茶為3 個不同發(fā)酵時期的水提物，即發(fā)酵前期為藏茶生產(chǎn)原料、發(fā)酵中期為渥堆發(fā)酵20 d、發(fā)酵后期為成品藏茶，以上藏茶均由吉祥藏茶公司提供。

取3 g 不同發(fā)酵時期的藏茶，采用三煎合一的方法熬煮30 min，將茶水與茶葉混合物離心，取上層清液并定容至150 mL，置于4 ℃冰箱中保存。

1.2 試驗動物分組及處理

將24 只C57BL/6J（雌性，18~22 g） 小鼠隨機(jī)分為4 組，分別為空白組（C）、藏茶發(fā)酵前（Q）組、藏茶發(fā)酵中（Z） 組、藏茶發(fā)酵后（H） 組。Q、Z、H 組中每只小鼠每天灌胃1 次0.14 mL 的不同時期的藏茶水提物，C 組用同樣體積的ddH2O 替代，持續(xù)灌胃28 d。每7 d 稱量每個組每只小鼠的體重，并記錄。28 d 后對小鼠進(jìn)行處死，采集小鼠肝臟組織、結(jié)腸組織、結(jié)腸內(nèi)容物和對小鼠眼球采血，眼球取出來的血用離心機(jī)分離血清并使用EP 管進(jìn)行收集，置于-80 ℃的凍藏室中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 小鼠肝臟抗氧化酶活性的測定

測定小鼠肝臟組織中的T-AOC、SOD 酶活性、MAD 含量，分析不同發(fā)酵程度的藏茶對小鼠體內(nèi)抗氧化能力的影響。

1.3.1 T-AOC 活性檢測

參考北京索萊寶科技有限公司《總抗氧化能力（T-AOC） 檢測試劑盒說明書》，以FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=10.829X+0.014 6（R2=0.999 5），各組水提物與反應(yīng)液反應(yīng)后，于波長593 nm 處測定吸光值，將ΔA'=A測定-A空白代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得X。測得總抗氧化能力（U/g） =X×V反總÷（V樣÷V樣總×W） （其中V樣總：加入提取液體積，1 mL；V反總：反應(yīng)總體積，1.02 mL；V樣：反應(yīng)中樣品體積，0.03 mL；W：樣品質(zhì)量，g），每個樣品設(shè)置3 個平行對照。

1.3.2 SOD 活性檢測

參照北京索萊寶科技有限公司《超氧化物歧化酶檢測試劑盒說明書》于560 nm 處測其吸光度，并以蒸餾水調(diào)零，按照ΔA測定=A測定-A空白、ΔA空白=A空1-A空2計算出△A測定和△A空白，計算抑制百分率=（ΔA空白-ΔA測定） ÷ΔA空白×100%，通過將抑制百分率帶入公式并計算SOD 活性：SOD 活性（U/mL） =[抑制百分率÷(1- 抑制百分率)×V反總]÷V樣×樣本稀釋度，（其中V樣總：加入提取液體積，1 mL；V反總：反應(yīng)體系總體積，1.026 mL；V樣：加入反應(yīng)體系中樣品的體積，0.09 mL；W：樣品質(zhì)量，g），每個樣品設(shè)置3 個平行對照。

1.3.3 MDA 含量檢測

參照北京索萊寶科技有限公司《丙二醛含量檢測試劑盒說明書》，用酶標(biāo)儀于波長450，532，600 nm 處進(jìn)行測定樣本吸光度，分別計算出：ΔA450=ΔA450測定-ΔA450空白、ΔA532=ΔA532測定-ΔA532空白、ΔA600=ΔA600測定-ΔA600空白、MAD=[(12.9×(ΔA532-ΔA600)-2.58×ΔA450)×V總]÷W×V樣本÷V提?。ㄆ渲蠽提取：加入提取液體積，1 mL；V總：反應(yīng)體系總體積，0.5 mL；V樣本：加入反應(yīng)體系中樣品的體積，0.1 mL；W：樣品質(zhì)量，g），每個樣品設(shè)置3 個平行對照。

1.4 小鼠肝臟和結(jié)腸組織的qPCR 檢測

參照南京唯贊生物科技有限公司《Total RNA 提取試劑盒說明書》取10~20 mg 的肝臟、結(jié)腸組織，提取RNA，再參照M-MLV 4 試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以肝臟、結(jié)腸組織cDNA為模板，進(jìn)行qPCR 擴(kuò)增，以5'-AGGTCGGTGTCAACGGATTTG-3'、5 ' -GGGGTCGTTGATGGCAACA -3'為內(nèi)參基因進(jìn)行PCR 的擴(kuò)增。

利用PCR 引物組合進(jìn)行半定量法qPCR 擴(kuò)增，分別測定肝臟（Cu/Zn-SOD、GSH-Px、Mn-SOD） 基因和結(jié)腸（COX-2、iNOS、NF-κB） 基因相對表達(dá)量，使用2-ΔΔCt方法計算mRNA 的相對表達(dá)水平。

肝臟、結(jié)腸組織qPCR 擴(kuò)增引物見表1。

表1 肝臟、結(jié)腸組織qPCR 擴(kuò)增引物

1.5 血清檢測

對小鼠血清樣本進(jìn)行1L-1β 的檢測，參照《Mouse IL-1β ELISA KIT 試劑盒》，標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=0.001 7X-0.038 3（R2=0.998 7），采用酶標(biāo)儀，以O(shè)D450nm-OD630nm的差值作為測量值。然后再用每個標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本的OD 測量值減去0 孔的OD 測量值作為標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的平均OD 值，樣品和標(biāo)準(zhǔn)曲線對比換算就能得出相應(yīng)的濃度。

1.6 腸道益生菌含量測定

取結(jié)腸內(nèi)容物樣品0.1~0.5 g，參照《OMEGA 糞便基因組DNA 提取試劑盒說明書》(由廣州飛揚(yáng)生物工程有限公司提取)提取DNA，將得到的DNA 溶液取1 μL 作為模板進(jìn)行qPCR 擴(kuò)增，使用乳酸菌、雙歧桿菌特定引物，檢測各組小鼠腸道內(nèi)容物中乳酸、雙歧桿菌的相對含量。

乳酸菌和雙歧桿菌特定引物見表2。

表2 乳酸菌和雙歧桿菌特定引物

1.7 數(shù)據(jù)處理

結(jié)果數(shù)據(jù)以X±SD表示（n=3），采用SPSS22.0統(tǒng)軟數(shù)據(jù)分析，Graphpad Prism 進(jìn)行作圖，顯著檢驗（p＜0.05=采用Duncan 極差法）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同時期發(fā)酵藏茶對小鼠體重的影響

小鼠體重變化見圖1。

圖1 小鼠體重變化

由圖1 可知，持續(xù)灌胃28 d 后，發(fā)現(xiàn)空白組小鼠體重緩慢升高，灌胃發(fā)酵前期藏茶水提物的小鼠體重呈現(xiàn)下降趨勢，體重下降率為1.77%；而發(fā)酵中期與發(fā)酵后期趨勢相似，最終體重均呈上升趨勢，體重上升率分別為0.87%和1.44%。

2.2 小鼠的抗氧化能力檢測

2.2.1 小鼠肝臟組織T-AOC

T-AOC 是反映檢測對象中各種抗氧化物質(zhì)和抗氧化酶能力的一個理化指標(biāo)?？偪寡趸芰χ档拇笮】梢杂脕砗饬靠寡趸芰Φ膹?qiáng)弱。

小鼠肝臟組織T-AOC（a）、SOD 活性（b）、MAD 含量（c） 的測定見圖2。

圖2 小鼠肝臟組織T-AOC（a）、SOD 活性（b）、MAD 含量（c） 的測定

由圖2（a） 可知，不同發(fā)酵時期的藏茶對于總抗氧化能力都有作用，Q、Z、H 組總抗氧化能力均強(qiáng)于C 組，發(fā)酵前期的藏茶總抗氧化能力為空白組的1.27 倍；Z 組與H 組的總抗氧化能力分別為1.22 倍與1.34 倍，其中H 組抗氧化能力最強(qiáng)。

2.2.2 小鼠肝臟組織SOD

自由基清除劑是一類能夠清除人體中過多自由基的活性物質(zhì)，SOD 是其中較為重要的一種。SOD活性越強(qiáng)，清除自由基的能力就越強(qiáng)。

由圖2（b） 可知，灌胃藏茶的小鼠體內(nèi)的SOD活性均高于空白組。Z 組、H 組的酶活性均高于Q組，其中Z 組的SOD 活性值為10.08 U/mL，H 組的SOD 活性值為9.80 U/mL。

2.2.3 小鼠體內(nèi)MDA 含量

由圖2（c） 可知，灌胃藏茶的試驗組的MDA 含量均低于C 組，且Q、Z、H 組的MDA 含量為Q＞Z＞H。MDA 含量越低，說明抗氧化能力越強(qiáng)。其中發(fā)酵后期的MDA 含量最低，為13.07 mol/g。

2.3 小鼠肝臟組織的抗氧化基因qPCR 檢測

小鼠肝臟組織抗氧化基因Cu/Zn-SOD（a）、GSH-Px（b）、Mn-SOD（c） 的表達(dá)見圖3。

圖3 小鼠肝臟組織抗氧化基因Cu/Zn-SOD（a）、GSH-Px（b）、Mn-SOD（c） 的表達(dá)

由圖3 可知，Cu/Zn-SOD、GSH-Px、Mn-SOD的表達(dá)水平試驗組均明顯高于空白組，Cu/Zn-SOD發(fā)酵前期是空白組的4.18 倍、發(fā)酵中期是空白組的2.88 倍、發(fā)酵后期是空白組的3.04 倍。GSH-Px 的表達(dá)水平發(fā)酵前期相較于空白組上調(diào)了2.33 倍，發(fā)酵中期相較于空白組上調(diào)了4.12 倍，發(fā)酵后期相較于空白組上調(diào)了3.19 倍。Mn-SOD 的表達(dá)水平發(fā)酵前期是空白組的2.05 倍，發(fā)酵中期是空白組的2.52 倍、發(fā)酵后期是空白組的1.82 倍。

2.4 小鼠結(jié)腸炎癥相關(guān)基因qPCR

小鼠結(jié)腸免疫基因COX-2（a）、iNOS（b）、NF-κB（c） 的表達(dá)見圖4。

圖4 小鼠結(jié)腸免疫基因COX-2（a）、iNOS（b）、NF-κB（c） 的表達(dá)

由圖4 可知，測定的COX-2、iNOS、NF-κB 3類基因中，正常情況下不表達(dá)，維持濃度相對較低。COX-2 在人體中和炎癥反應(yīng)相關(guān)，當(dāng)人體細(xì)胞受到炎癥刺激時，COX-2 的表達(dá)水平快速上升，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)和組織損傷；iNOS 則是當(dāng)細(xì)胞受外界炎癥等刺激后表達(dá)水平提高，取協(xié)助巨噬細(xì)胞加強(qiáng)免疫功能；NF-κB 則是在細(xì)胞炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答中起關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，藏茶Q、Z、H 3 組相對空白組COX-2、iNOS、NF-κB 這3 類炎癥基因的表達(dá)水平顯著下降，故試驗的3 組小鼠的免疫能力強(qiáng)于空白組，而在Q、Z、H 這3 組中，3 類基因的表達(dá)水平呈現(xiàn)隨發(fā)酵時間越長，其表達(dá)水平越低的趨勢，即隨著發(fā)酵時間增長，藏茶對免疫功能的提升就越好，這說明COX-2、iNOS、NF-κB 3 類基因可能有潛在的降低炎癥的作用。

2.5 小鼠血清1L-1β 測定

小鼠血清1L-1β 濃度的測定見圖5。

圖5 小鼠血清1L-1β 含量的測定

由圖5 可知，相對空白組，Z 組、H 組的1L-1β的質(zhì)量濃度都下降，數(shù)值分別為54.294 pg/mL 和51.353 pg/mL，且H 組相較于Z 組下降得更多。而Q組相對于C 組1L-1β 的質(zhì)量濃度有上升趨勢。即藏茶隨著發(fā)酵時間的增加小鼠體內(nèi)的1L-1β 質(zhì)量濃度總體呈現(xiàn)減小的趨勢。

2.6 小鼠結(jié)腸內(nèi)容物有益菌基因qPCR

小鼠腸道乳酸菌、雙歧桿菌增長水平分析見圖6。

圖6 小鼠腸道乳酸菌、雙歧桿菌增長水平分析

研究發(fā)現(xiàn)，不同發(fā)酵程度藏茶對腸道益生菌有著顯著的上調(diào)作用，相較于C 組，腸道益生菌至少有2 倍以上的增長，且發(fā)酵程度越深對于益生菌增長的促進(jìn)作用就越大，其中發(fā)酵后期的促進(jìn)作用最為顯著，發(fā)酵后期的藏茶至少都是6 倍的增長促進(jìn)。由圖6 可知，與C 組相比較，發(fā)酵后期的乳酸菌增長了8 倍多，雙歧桿菌增長接近7 倍左右，說明發(fā)酵后期乳酸菌的促進(jìn)作用大于雙歧桿菌；發(fā)酵中期對于2 種益生菌的促進(jìn)作用都是3 倍左右；而發(fā)酵前期則對雙歧桿菌的促進(jìn)作用大于乳酸菌，雙歧桿菌較C 組增加4 倍左右，乳酸菌則是2 倍左右。結(jié)果表明，H 組的藏茶乳酸菌和雙歧桿菌數(shù)量相對Q組、Z 組增長得最為明顯，特別是乳酸菌增長的倍數(shù)最為顯著。

3 討論

探究不同發(fā)酵時期藏茶對小鼠機(jī)體抗氧化能力和腸道益生菌及免疫功能影響，有利于進(jìn)一步開發(fā)藏茶的保健功能和市場價值。藏茶中茶多糖、茶多酚、茶褐素等物質(zhì)都具有較好的抗氧化能。Zheng Q等人[11]研究也發(fā)現(xiàn)從雅安藏茶中提取的藏茶多糖和茶多酚均具有較強(qiáng)的自由基清除能力，因而藏茶及其提取物有較強(qiáng)的抗氧化活性。王凝等人[12]對不同陳化時間藏茶的抗氧化活性進(jìn)行評估，發(fā)現(xiàn)陳化時間越長，藏茶的抗氧化性越弱。試驗是選用一種藏茶的3個不同發(fā)酵時期對小鼠機(jī)體內(nèi)抗氧化能力的影響進(jìn)行探究。發(fā)現(xiàn)發(fā)酵中、后期的藏茶對小鼠的機(jī)體內(nèi)抗氧化能力影響較大，抗氧化能力在總體的趨勢上還是隨著發(fā)酵時間的延長，這可能是受到藏茶在渥堆發(fā)酵過程中其具有不同作用的活性物質(zhì)含量隨著時間發(fā)生相應(yīng)變化的影響[13]，藏茶中的物質(zhì)會發(fā)生不斷的轉(zhuǎn)化，隨著發(fā)酵時間的延長，藏茶內(nèi)的物質(zhì)轉(zhuǎn)化為小分子并且有利于機(jī)體吸收，從而表現(xiàn)出對體內(nèi)抗氧化能力的不同影響。也可能是藏茶發(fā)酵過程中會產(chǎn)生許多氧化態(tài)多酚，這些物質(zhì)可能也對機(jī)體有抗氧化能力。研究發(fā)現(xiàn)，隨著發(fā)酵時間的延長T-AOC、SOD 酶活性相較于C 組都有顯著的延長；MDA 含量具有顯著下降，說明隨著發(fā)酵時間的增加藏茶的抗氧化能力增強(qiáng)，尤其是發(fā)酵后期的抗氧化能力增強(qiáng)得最為顯著。

雙歧桿菌和乳酸菌是常見的腸道益生菌，在維持腸道菌群的平衡和穩(wěn)定方面具有重要的影響，腸道菌群在人體的代謝、營養(yǎng)、保護(hù)、免疫調(diào)節(jié)等方面有著重要且不可替代的功能。雙歧桿菌具有明顯的抗氧化作用，能增加血液中SOD 的含量及其生物活性。人體新陳代謝過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)可以通過益生菌合成對人體有益的微量元素、氨基酸、超氧化歧化酶等多種抗氧化物質(zhì)[14]。Wang N 等人[15]證實藏茶提取物（TTE） 可以調(diào)節(jié)潰瘍性結(jié)腸炎（UC）的免疫系統(tǒng)，減少炎癥。腸道益生菌不僅能夠激活內(nèi)源性細(xì)菌的代謝，使得腸道的非免疫性防護(hù)屏障得到提升；它還可以調(diào)節(jié)腸道IgA 反應(yīng)和消除腸道炎癥反應(yīng)，提升腸道的免疫防御屏障功能，益生菌可以通過調(diào)節(jié)機(jī)體非特異性和特異性免疫反應(yīng)，增強(qiáng)機(jī)體免疫力[16]。Liu Z 等人[17]使用結(jié)腸炎模型小鼠發(fā)現(xiàn)六大茶類對腸道益生菌都有一定的促進(jìn)作用。李丹[18]的研究表明，經(jīng)過渥堆的普洱熟茶對乳酸菌的增長的促進(jìn)作用效果不如茯磚茶，對于雙歧桿菌的促進(jìn)作用不如普洱生茶。這些種類的茶葉的作用和藏茶相比，藏茶對于這乳酸菌和雙歧桿菌的作用更好，且渥堆發(fā)酵時間越長，對于有益菌的提升就越好。通過測量小鼠腸道中益生菌的基因表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，藏茶對有益菌具有很好的促進(jìn)作用。通過對小鼠結(jié)腸內(nèi)容物進(jìn)行半定量qPCR 分析，發(fā)現(xiàn)不同發(fā)酵時期藏茶對小鼠腸道乳酸菌和雙歧桿菌均有顯著上調(diào)作用，特別是發(fā)酵后期對乳酸菌和雙歧桿菌促進(jìn)增長作用更為顯著，說明藏茶可以通過上調(diào)腸道益生菌，起到保健功能。

免疫功能是人體抵御外界致病菌、微小有害物等對人體有危害作用的物質(zhì)的重要防線，同時也是清除人體內(nèi)環(huán)境產(chǎn)生的損傷細(xì)胞、癌細(xì)胞等對人體不利的物質(zhì)的手段。李海珊等人[19]研究發(fā)現(xiàn)，茶多糖可增強(qiáng)小鼠非特異性免疫調(diào)節(jié)功能；程利增等人[20]發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫是天然多糖最顯著的生物學(xué)功能之一，是多糖抗腫瘤效應(yīng)的關(guān)鍵基礎(chǔ)。通過對小鼠的28 d 內(nèi)的結(jié)腸組織免疫基因表達(dá)水平變化、血清中1L-1β 含量等指標(biāo)的測量，發(fā)現(xiàn)不同發(fā)酵時期的藏茶對于小鼠的免疫功能都有影響，其中發(fā)酵前、中、后3 個時期總體上都提升了小鼠的免疫功能，藏茶發(fā)酵前的1L-1β 的含量最高。藏茶前、中、后3 組相對空白組COX-2、iNOS、NF-κB 這3 類基因的表達(dá)水平明顯下降，故Q、Z、H 組小鼠的免疫能力強(qiáng)于C 組，而在Q、Z、H 這3 組中，3 類基因的表達(dá)水平呈現(xiàn)隨發(fā)酵時間越長，其表達(dá)水平越低的趨勢，即隨著發(fā)酵時間增長，藏茶對免疫功能的提升越好。在免疫基因表達(dá)時，對于NF-κB 基因而言發(fā)酵中期的藏茶對小鼠的作用效果最顯著，這可能與藏茶渥堆發(fā)酵過程中相關(guān)活性物質(zhì)的變化有關(guān)。在發(fā)酵過程中茶多酚、兒茶素下降，茶褐素增加[21]這一動態(tài)過程使得發(fā)酵中期的藏茶對小鼠的NF-κB 的表達(dá)水平作用最顯著。

4 結(jié)論

對小鼠體內(nèi)抗氧化能力、免疫能力以及對腸道益生菌的影響進(jìn)行了測定。研究發(fā)現(xiàn)，不同時期藏茶對抗氧化能力都均有顯著的提高效果，但其中發(fā)酵后期對總抗氧化能力有著明顯的增強(qiáng)效果；此外，SOD 酶活性發(fā)酵中期和后期都顯著提高；可以說MDA 含量在藏茶發(fā)酵后期下降的趨勢最顯著，表明發(fā)酵后期的藏茶中對抗氧化能力有效的物質(zhì)含量最多。隨著發(fā)酵時間的延長，對小鼠的免疫功能增強(qiáng)作用也更好，這可能是受到藏茶在渥堆發(fā)酵過程中其具有不同作用的活性物質(zhì)含量隨著時間發(fā)生相應(yīng)變化的影響。值得關(guān)注的是，藏茶對于腸道中雙歧桿菌和乳酸菌的含量有著顯著的上調(diào)作用，且渥堆發(fā)酵的時間越長，對于有益菌的提升就越好。探究了不同發(fā)酵時期藏茶的保健功能，為藏茶的進(jìn)一步開發(fā)與利用提供了理論依據(jù)。