王江俠，楊麗霞，米登海，魏瑞賢，崔陽陽，馬仙康

當(dāng)歸多糖對糖尿病腎病KK-Ay小鼠腎臟AMPK信號通路及線粒體自噬的影響

王江俠1，楊麗霞2*，米登海2，魏瑞賢1，崔陽陽1，馬仙康1

1. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000 2. 甘肅省中醫(yī)藥研究院，甘肅 蘭州 730050

研究當(dāng)歸多糖對糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）KK-Ay小鼠腎臟磷酸腺苷激活的蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）信號通路及線粒體自噬的影響。SPF級雄性KK-Ay小鼠用高糖高脂飼料喂養(yǎng)，隨機分為模型組、厄貝沙坦（25 mg/kg）組和當(dāng)歸多糖高、中、低劑量（400、200、100 mg/kg）組，每組10只；將10只雄性C57BL/6J小鼠作為對照組。給予藥物干預(yù)4周，觀察小鼠一般情況，每周稱定體質(zhì)量并檢測血糖；末次給藥后，心臟取血并處死小鼠，分離血清檢測尿微量白蛋白（urine microalbuminuria，U-ALB）、肌酐（creatinine，SCr）、尿素氮（urea nitrogen，BUN）；采用蘇木素-伊紅（HE）染色觀察腎組織病理變化；采用Western blotting檢測腎組織線粒體自噬相關(guān)蛋白[微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）、p62、Nix]和線粒體裂變蛋白[線粒體動力相關(guān)蛋白1（dynamin-related protein 1，Drp1）]的表達；采用免疫組化法檢測腎組織AMPK、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）蛋白表達；采用qRT-PCR檢測腎組織、mRNA表達。與模型組比較，各給藥組U-ALB、SCr、BUN水平均明顯降低（＜0.05、0.01），呈劑量相關(guān)性；腎組織病理變化有所改善；腎組織線粒體自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Nix蛋白表達水平顯著降低（＜0.01），p62蛋白表達水平顯著升高（＜0.05）；線粒體裂變蛋白Drp1表達下調(diào)（＜0.01）；AMPK、mTOR蛋白及mRNA表達顯著下調(diào)（＜0.05、0.01）。當(dāng)歸多糖能改善DN小鼠腎損傷，延緩DN發(fā)病進展，其作用機制與抑制AMPK信號通路介導(dǎo)的線粒體自噬有關(guān)。

當(dāng)歸多糖；糖尿病腎??；KK-Ay小鼠；線粒體自噬；磷酸腺苷激活的蛋白激酶信號通路

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是2型糖尿?。╰ype 2 diabetes，T2DM）最常見且最嚴重的并發(fā)癥之一，是終末期腎臟疾?。╡nd stage renal disease，ESRD）的主要原因[1]。在2017年因DN死亡的人約為219 451，從1990年開始呈現(xiàn)穩(wěn)定增長趨勢[2]，到2035年，全球范圍內(nèi)35%～40%的T2DM會發(fā)展為DN[3]，這給家庭和社會帶來嚴重的經(jīng)濟及心理負擔(dān)。目前，治療DN并沒有特定藥物，主要通過控制血糖和血壓來降低發(fā)生ESRD的風(fēng)險，但并不能長期阻止DN的進展。因此，尋求改善糖尿病腎病的方法具有重要意義。

中藥長期應(yīng)用于糖尿病及其并發(fā)癥的治療，具有不良反應(yīng)少、安全性高等特點。當(dāng)歸是臨床上治療DN的方劑中最常用的中藥之一，并且具有良好的臨床療效。當(dāng)歸多糖作為當(dāng)歸的主要活性成分，具有改善貧血、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、調(diào)血脂[4]、治療糖尿病腎病[5]的藥理作用，可以改善DN。當(dāng)歸多糖是天然植物提取物，具有多途徑、多靶點、成分穩(wěn)定等優(yōu)點，能夠通過多種機制作用于疾病，因此將當(dāng)歸多糖開發(fā)為治療DN的藥物具有良好的前景。但當(dāng)歸多糖對DN的療效和潛在機制尚不完全清楚，還需進行多層次的研究。

腎臟中含有豐富的線粒體，是線粒體含量第二高的器官[6-7]。越來越多的研究表明，線粒體功能障礙在糖尿病腎臟疾病的發(fā)病機制中起著重要作用[8]。線粒體質(zhì)量控制的缺失會導(dǎo)致線粒體功能障礙，因此維持線粒體穩(wěn)態(tài)和質(zhì)量控制對DN至關(guān)重要。線粒體質(zhì)量控制中重要的一個環(huán)節(jié)就是線粒體自噬，通過選擇性的清除受損或多余的線粒體，從而保護正常的線粒體功能[9]。目前許多研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)控線粒體自噬能改善DN，是防治DN的重要作用機制之一[10-11]。線粒體自噬由PTEN誘導(dǎo)的蛋白激酶1（PTEN induced putative kinase 1，PINK1）/ Parkin通路和線粒體自噬受體信號通路介導(dǎo)[11]，磷酸腺苷激活的蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）為線粒體代謝和線粒體自噬的關(guān)鍵參與者[12-13]。本研究通過觀察當(dāng)歸多糖在DN中的作用，探索當(dāng)歸多糖在KK-Ay小鼠T2DM模型中與AMPK介導(dǎo)的線粒體自噬相關(guān)的潛在機制。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性KK-Ay小鼠50只、C57BL/6J小鼠10只，10～12周齡，體質(zhì)量（38±2）g，均購自北京華阜康生物科技有限公司，許可證號SCXK（京）2019-0008。高糖高脂飼料、普通小鼠飼料購自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心。動物飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，每5只為一籠，晝夜循環(huán)，充分保證小鼠的適宜活動空間，每周更換2次籠內(nèi)墊料，確保小鼠生存環(huán)境的潔凈，室內(nèi)溫度為26.7 ℃，自由進食飲水。動物實驗經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號2021-368）。

1.2 藥品與試劑

當(dāng)歸多糖（批號CY210714，多糖質(zhì)量分數(shù)為98.14%）購自西安楊凌慈緣生物技術(shù)有限公司；厄貝沙坦片（批號DA282，國藥準(zhǔn)字J20080061）購自杭州賽諾菲安萬特民生制藥有限公司；尿微量白蛋白（urine microalbuminuria，U-ALB）、肌酐（creatinine，SCr）、尿素氮（urea nitrogen，BUN）試劑盒（批號分別為202205、m1092663、m1210673）購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（批號20191104）購自北京索萊寶科技有限公司；微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）抗體（批號BST17924827）購自武漢博士德生物工程有限公司；p62抗體（批號00048269）購自Proteintech公司；Nix抗體（批號GR39116-6）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（批號GR303514-13）購自英國Abcam公司；線粒體動力相關(guān)蛋白1（dynamin-related protein 1，Drp1）抗體（批號AB04263210）、AMPK抗體（批號bsm-3426M）、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）抗體（批號bs-1992R）購自北京博奧森生物科技有限公司；山羊抗兔二抗（批號CR2102123）購自武漢賽維爾生物科技有限公司；RNAex Pro RNA提取試劑、Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄預(yù)混型試劑盒、SYBR Green Pro Taq HS預(yù)混型qPCR試劑盒（批號分別為A3A2161、A4A0056、A4A0185）購自Accurate Biotechnology。

1.3 儀器

5424R型高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；iMark酶標(biāo)儀、梯度PCR儀（美國Bio-Rad公司）；StepOne Plus實時定量PCR儀（美國Thermo公司）；MX-S型渦旋振蕩器（美國賽洛捷克公司）；DYCZ-40G型Western blotting轉(zhuǎn)膜儀、DYCZ-25D型電泳儀（北京六一生物科技公司）；MiniChemi 610型化學(xué)發(fā)光成像儀（北京賽智科技有限公司）；ACCU-CHEK Performa血糖儀（瑞士羅氏公司）；DM2500型顯微鏡（德國Leica公司）。

2 方法

2.1 DN小鼠模型建立、分組及給藥

小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，取10只C57BL/6J小鼠作為正常組，以普通飼料喂養(yǎng)；50只KK-Ay小鼠用高糖高脂飼料喂養(yǎng)。KK-Ay小鼠是T2DM的自發(fā)動物模型，隨機監(jiān)測小鼠血糖，KK-Ay小鼠隨機血糖≥13.9 mmol/L，出現(xiàn)微量蛋白尿，即視為成功構(gòu)建DN模型[14-15]。將造模成功的KK-Ay小鼠隨機分為模型組、厄貝沙坦（25 mg/kg）組和當(dāng)歸多糖高、中、低劑量（400、200、100 mg/kg，根據(jù)人和動物體表面積等效劑量比率表計算[16]）組，每組10只。各給藥組ig相應(yīng)藥物，正常組和模型組ig等體積生理鹽水，1次/d，連續(xù)4周。

2.2 取樣

末次給藥后，收集小鼠24 h尿液，于?20 ℃保存待測；小鼠禁食不禁水12 h后，ip 10%水合氯醛麻醉，行心臟采血，4 ℃、3500 r/min離心10 min，分離血清，?80 ℃保存?zhèn)溆??？焖俜蛛x兩側(cè)腎臟，左腎置于4%多聚甲醛中，室溫固定備用；右腎縱向切開去除腎髓質(zhì)，?80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 小鼠一般情況及生化指標(biāo)檢測

觀察小鼠皮毛的光澤度、活動度、精神狀態(tài)及進食情況等。按照試劑盒說明書檢測U-ALB、SCr、BUN水平。

2.4 HE染色觀察腎臟組織病理學(xué)變化

取出固定在4%多聚甲醛中的腎組織，經(jīng)脫水、浸蠟、包埋后，將包埋好的蠟塊切成薄片，然后進行HE染色，于顯微鏡下觀察并拍照。

2.5 Western blotting檢測線粒體自噬蛋白LC3、p62、Nix和線粒體裂變蛋白Drp1的表達

取研碎的腎組織200 mg，加入RIPA蛋白裂解液2 mL，冰上充分裂解，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清。使用BCA法進行蛋白定量分析，加30 μL 5×上樣緩沖液，混勻，在100 ℃沸水中加熱10 min使蛋白變性。蛋白樣品經(jīng)12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，用5%脫脂牛奶封閉1.5 h，分別加入p62（1∶1000）、Nix（1∶1000）、Drp1（1∶1000）、LC3（1∶500）、GAPDH（1∶3000）抗體，4 ℃孵育過夜；TBST洗膜，加入二抗（1∶6000），室溫孵育1 h，TBST洗膜，滴加發(fā)光液，反應(yīng)5 min。使用化學(xué)發(fā)光成像儀曝光，采用Image J軟件分析條帶灰度值。

2.6 免疫組化檢測腎組織AMPK和mTOR蛋白表達

取腎組織石蠟切片，脫蠟、水化，檸檬酸鈉熱修復(fù)2次，3% H2O2孵育15 min，血清37 ℃封閉30 min，滴加AMPK、mTOR抗體（1∶100），4 ℃孵育過夜，37 ℃復(fù)蘇后，滴加二抗，37 ℃孵育30 min，滴加三抗，37 ℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片。在每張切片中選取5個視野，使用Image Pro Plus 6軟件進行分析。

2.7 qRT-PCR檢測腎組織AMPK、mTOR mRNA表達

取100 mg腎組織研磨成粉末狀，加入1 mL RNAex Pro提取總RNA，經(jīng)超微量分光光度計測定RNA的濃度和純度，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，進行qRT-PCR分析。引物序列見表1。

2.8 統(tǒng)計學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 當(dāng)歸多糖對DN小鼠體征的影響

實驗期間，模型組出現(xiàn)多飲多食、皮毛枯槁易脫落、蜷縮懶動等現(xiàn)象，甚至出現(xiàn)皮膚潰瘍等并發(fā)癥。各給藥組小鼠癥狀和體征較模型組有明顯改善。

表1 引物序列

3.2 當(dāng)歸多糖對DN小鼠腎功能的影響

如表2所示，與對照組比較，模型組U-ALB、SCr、BUN水平均明顯升高（＜0.01）；與模型組比較，厄貝沙坦組和當(dāng)歸多糖高、中劑量組U-ALB、SCr、BUN水平均明顯降低（＜0.05、0.01），且呈劑量相關(guān)性。

表2 當(dāng)歸多糖對DN小鼠腎功能的影響(, n = 8)

與對照組比較：##＜0.01；與模型組比較：*＜0.05**＜0.01，下表同

##< 0.01control group;*< 0.05**< 0.01model group, same as below tables

3.3 當(dāng)歸多糖對DN小鼠腎臟病理變化的影響

如圖1所示，對照組腎組織結(jié)構(gòu)清晰完整，細胞大小均一，腎小管排列緊密，基底膜完整，未見炎性細胞浸潤；與對照組比較，模型組腎小管壁出現(xiàn)大量空泡樣變性，腎組織排列疏松，出現(xiàn)間隙，結(jié)構(gòu)紊亂，腎小球出現(xiàn)萎縮，出現(xiàn)炎性細胞浸潤；與模型組比較，厄貝沙坦組細胞排列紊亂，腎小管依然有較多空泡，且組織內(nèi)有出血現(xiàn)象，腎小球基底膜損傷，腎小球萎縮；當(dāng)歸多糖各劑量組細胞排列逐漸緊密，空泡樣變性明顯減少，腎小管排列整齊，腎小球逐漸恢復(fù)大小，腎小管壁逐漸完整，出血現(xiàn)象減少，且呈劑量相關(guān)性。

3.4 當(dāng)歸多糖對DN小鼠腎組織LC3、p62、Nix蛋白表達的影響

如圖2所示，與對照組比較，模型組小鼠腎組織LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Nix蛋白表達水平均顯著升高（＜0.01），p62蛋白表達水平顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，厄貝沙坦組和當(dāng)歸多糖高劑量組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達水平顯著降低（＜0.01），厄貝沙坦組和當(dāng)歸多糖低、高劑量組Nix蛋白表達水平顯著降低（＜0.01），各給藥組p62蛋白表達水平顯著升高（＜0.01）。

3.5 當(dāng)歸多糖對DN小鼠腎組織Drp1蛋白表達的影響

如圖3所示，與對照組比較，模型組小鼠腎組織Drp1蛋白表達水平顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，厄貝沙坦組和當(dāng)歸多糖高、中劑量組Drp1蛋白表達水平顯著降低（＜0.01）。

3.6 當(dāng)歸多糖對DN小鼠腎組織AMPK、mTOR mRNA表達的影響

如表3所示，與對照組比較，模型組小鼠腎組織、mRNA表達水平均顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠腎組織、mRNA表達水平均顯著降低（＜0.01）。

箭頭表示腎細胞空泡樣變性、腎小球萎縮、炎性細胞浸潤

與對照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：**P＜0.01，圖3同

圖3 當(dāng)歸多糖對DN小鼠腎組織Drp1蛋白表達的影響(, n = 3)

3.7 當(dāng)歸多糖對DN小鼠腎組織AMPK、mTOR蛋白表達的影響

如圖4和表4所示，與對照組比較，模型組小鼠腎組織中AMPK、mTOR蛋白表達水平均顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，厄貝沙坦組和當(dāng)歸多糖中、高劑量組AMPK、mTOR蛋白表達水平均顯著降低（＜0.05、0.01）。

表3 當(dāng)歸多糖對DN小鼠腎組織AMPK和mTOR mRNA表達的影響(, n = 3)

4 討論

自發(fā)性T2DM動物模型KK-Ay小鼠在8～20周齡中表現(xiàn)出DN，其腎小球的病理變化與人類DN的早期階段一致[17]，因此KK-Ay小鼠被認為是研究DN的合適動物實驗?zāi)Ｐ汀８鶕?jù)中醫(yī)理論，氣虛血瘀是DN的常見證型，隨著病情的發(fā)展，會出現(xiàn)陰血虧虛、瘀血阻滯，因此，補血活血化瘀是中醫(yī)治療DN的關(guān)鍵。當(dāng)歸具有補血活血的功效，是治療DN的常用中藥。當(dāng)歸的活性成分當(dāng)歸多糖具有改善DN的療效[18-19]，但是具體機制并不完全清楚。在DN大鼠模型中，當(dāng)歸多糖可降低腎組織中炎性指標(biāo)，改善DN[18]。石毅瓊[19]發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸多糖能抑制腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化的發(fā)生，通過降低轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）/ Smads信號通路活性延緩糖尿病腎纖維化的發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)歸多糖能夠降低KK-Ay小鼠U-ALB并改善了腎損傷，AMPK介導(dǎo)的線粒體自噬在KK-Ay小鼠的腎臟中被激活，給予當(dāng)歸多糖干預(yù)后線粒體自噬下調(diào)。

圖4 當(dāng)歸多糖對DN小鼠腎組織AMPK和mTOR蛋白表達的影響(免疫組化，×400)

表4 當(dāng)歸多糖對DN小鼠腎組織AMPK和mTOR蛋白表達的影響(, n = 3)

越來越多的研究證明線粒體功能障礙會影響DN的發(fā)展[8]。線粒體不斷通過裂變?nèi)诤?、生物發(fā)生及線粒體自噬保持動態(tài)平衡，其中線粒體自噬可以清除受損線粒體發(fā)揮著重要作用[20]。然而線粒體自噬是一把雙刃劍，中度線粒體自噬可去除受損線粒體，減少細胞死亡和組織損傷，而線粒體自噬障礙或線粒體自噬過度都可引起細胞能量代謝紊亂，加重細胞凋亡[21]，表明線粒體自噬過度對細胞是有害的。先前的研究報道DN的線粒體自噬狀態(tài)并不一致。在鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠模型中，AMPK激動劑二甲雙胍能通過p-AMPK/PINK1/Parkin通路激活線粒體自噬，改善腎小管間質(zhì)纖維化[22]，AMPK通路的激活會誘導(dǎo)線粒體自噬并促進線粒體裂變[23]。益氣解毒方能夠抑制DN大鼠模型的線粒體過度自噬[24]，黃芪甲苷可以減輕PINK1/Parkin介導(dǎo)的腎小管上皮細胞線粒體自噬[25]。這些不同的結(jié)果也可能是受動物模型、用藥劑量及實驗周期等因素的影響，因此，還需進一步研究藥物在不同的動物模型或其他條件下對線粒體自噬水平的影響，觀察這種變化對DN是有益還是有害。

AMPK充當(dāng)細胞的能量傳感器，是線粒體生物發(fā)生的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，其激活會促進線粒體自噬。AMPK與下游分子協(xié)同作用在線粒體自噬中發(fā)揮著重要作用，mTOR是AMPK的關(guān)鍵下游靶點，是自噬的負調(diào)節(jié)因子[26]。LC3和p62是重要的自噬標(biāo)記蛋白。p62通過與LC3結(jié)合，誘導(dǎo)自噬體形成，從而吞噬并清除受損線粒體，p62水平與自噬通量成反比。當(dāng)自噬體形成時，胞質(zhì)蛋白LC3I通過酶水解轉(zhuǎn)化為LC3Ⅱ，LC3Ⅱ的升高代表自噬的開始[27]，因此LC3Ⅱ/LC3Ⅰ值的大小可估計自噬水平的高低。Nix是一種線粒體自噬受體蛋白，能夠與LC3蛋白結(jié)合誘導(dǎo)線粒體自噬的發(fā)生[28]，線粒體自噬隨著Nix的增加而增強。線粒體裂變是線粒體自噬的先決條件，通過將線粒體分裂成易于自噬體吞噬的片段，然后將其包裹在自噬囊泡中[29]，促進線粒體自噬清除受損線粒體[30]。Drp1是線粒體裂變的主要調(diào)控因子，促進Drp1表達有助于線粒體裂變[31]，線粒體裂變過多是糖尿病腎臟中線粒體功能障礙的特征之一，其過程對腎臟有害。Drp1過表達不僅增加了線粒體裂變，而且加速了線粒體自噬通量，線粒體裂變和線粒體自噬之間具有相互正向作用[32]，線粒體裂變可以誘導(dǎo)線粒體自噬發(fā)生，因此在本實驗中研究了線粒體裂變。

本研究結(jié)果顯示，線粒體裂變調(diào)節(jié)因子Drp1在模型組小鼠腎臟的表達顯著上調(diào)，在當(dāng)歸多糖組的表達顯著降低，這表明當(dāng)歸多糖抑制了DN小鼠的線粒體分裂。與模型組相比，當(dāng)歸多糖組小鼠腎臟的線粒體自噬相關(guān)蛋白LC3、Nix的表達明顯下降，p62的表達明顯增加，AMPK、mTOR蛋白及mRNA的表達下降，其中當(dāng)歸多糖高劑量組療效最佳，表明當(dāng)歸多糖抑制了DN小鼠的線粒體自噬。mTOR是AMPK的下游靶點，AMPK能夠抑制mTOR的活性從而激活自噬，而在本研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，AMPK并沒有抑制mTOR活性，因此推斷當(dāng)歸多糖可能不是通過AMPK/mTOR信號軸調(diào)節(jié)線粒體自噬，而是通過抑制AMPK通路及其他下游分子來減輕線粒體自噬。線粒體裂變對線粒體自噬具有正向作用，當(dāng)歸多糖可能是通過抑制小鼠腎臟的線粒體裂變進一步減輕線粒體自噬，兩者之間的相互作用還需進一步研究。本研究還存在許多不足，可以在后續(xù)研究中，通過體外實驗觀察當(dāng)歸多糖對DN小鼠腎小管上皮細胞的影響及線粒體自噬的動態(tài)變化，研究AMPK信號通路的其他信號軸及靶蛋白，確定調(diào)節(jié)線粒體自噬的具體信號通路。通過這些實驗，進一步驗證當(dāng)歸多糖是否通過體內(nèi)AMPK信號通路調(diào)節(jié)線粒體自噬，明確當(dāng)歸多糖防治DN的具體分子機制。

綜上，當(dāng)歸多糖改善了KK-Ay小鼠的DN，這可能與抑制AMPK介導(dǎo)的線粒體自噬有關(guān)。本研究揭示了當(dāng)歸多糖對KK-Ay小鼠T2DM模型中AMPK介導(dǎo)的線粒體自噬調(diào)節(jié)作用。然而，當(dāng)歸多糖如何調(diào)節(jié)線粒體自噬及線粒體自噬如何促進糖尿病腎病還需要進一步的研究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect ofpolysaccharides on AMPK signaling pathway and mitochondrial autophagy in kidney of diabetic nephropathy KK-Ay mice

WANG Jiang-xia1, YANG Li-xia2, MI Deng-hai2, WEI Rui-xian1, CUI Yang-yang1, MA Xian-kang1

1. Gansu University of Traditional Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China 2. Gansu Province Academy of Chinese Medicine, Lanzhou 730050, China

To study the effects ofpolysaccharides (ASP) on AMP activated protein kinase (AMPK) signaling pathway and mitochondrial autophagy in kidney of KK-Ay mice with diabetes nephropathy (DN).SPF male KK-Ay mice were fed with high sugar and high fat diet and randomly divided into model group, irbesartan (25 mg/kg) group, ASP high-, medium-, and low-dose (400, 200, 100 mg/kg) groups, with 10 mice in each group, 10 male C57BL/6J mice were used as control group. Drugs were given for intervention for four weeks, the general condition of mice was observed, body weight and blood sugar were measured weekly; After the last administration, blood was taken from heart and mice were euthanized. Serum was separated and tested for urinary microalbuminuria (U-ALB), creatinine (SCr), and urea nitrogen (BUN); Pathological changes of renal tissue was observed by hematoxylin eosin (HE) staining; Western blotting was used to detect the expressions of mitochondrial autophagy related proteins [microtubule associated protein 1 light chain 3 (LC3), p62, Nix] and mitochondrial fission protein [mitochondrial related protein 1 (Drp1)] in renal tissue; Immunohistochemical method was used to detect the expressions of AMPK and mammalian target of rapamycin (mTOR) protein in renal tissue; The expressions ofandmRNA in renal tissue were detected by qRT-PCR.Compared with model group, levels of U-ALB, SCr and BUN in each treatment group were significantly reduced (< 0.05, 0.01), showing a dose-dependent relationship; The pathological changes of renal tissue was improved; The expression levels of mitochondrial autophagy related proteins LC3II/LC3I and Nix in renal tissue were significantly reduced (< 0.01), while the expression level of p62 protein was significantly increased (< 0.05); The expression of mitochondrial fission protein Drp1 was downregulated (< 0.01); AMPK, mTOR protein and mRNA expressions were significantly downregulated (< 0.05, 0.01).ASP can improve renal injury in DN mice and delay the progression of DN. Its mechanism is related to the inhibition of AMPK signaling pathway mediated mitochondrial autophagy.

polysaccharides; diabetic nephropathy; KK-Ay mice; mitochondrial autophagy; AMP-activated protein kinase signaling pathway

R285.5

A

0253 - 2670(2023)10 - 3189 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.10.016

2022-12-06

隴藥大品種二次開發(fā)及臨床療效評價行業(yè)技術(shù)中心（2019）；甘肅省省屬科研院所條件建設(shè)專項（20JR10RA432）

王江俠（1997—），女，碩士研究生，研究方向為中醫(yī)藥防治糖尿病。Tel: 15179112512 E-mail: 2605469879@qq.com

楊麗霞（1979—），女，博士，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，研究方向為中醫(yī)藥防治糖尿病。E-mail: yanglixia-415@163.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]