張 星，賴文靜，林 夏，黃 友，楊莎莎，郝怡雯，周靖惟，傅超美，胡昌江，董 艷，耿福能，張 臻, 2

Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化經(jīng)典名方四妙勇安湯煎煮工藝研究

張 星1，賴文靜1，林 夏1，黃 友1，楊莎莎1，郝怡雯1，周靖惟1，傅超美1，胡昌江1，董 艷1，耿福能1*，張 臻1, 2*

1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，西南特色中藥資源國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611137 2. 四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展有限公司 中藥配方顆粒質(zhì)量與療效評(píng)價(jià)重點(diǎn)研究室，四川 彭州 610031

遵循中醫(yī)藥傳承創(chuàng)新發(fā)展的基本準(zhǔn)則——“遵古原則”，考察經(jīng)典名方四妙勇安湯（Simiao Yong’an Decoction，SYD）的煎煮工藝，確保原湯劑原汁原味的傳統(tǒng)功效，并進(jìn)行質(zhì)量綜合評(píng)價(jià)，為經(jīng)典名方SYD進(jìn)一步制劑開發(fā)提供參考。采用Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法對(duì)加水量、浸泡時(shí)間、煎煮時(shí)間進(jìn)行考察，通過指紋圖譜結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析進(jìn)行定性半定量評(píng)價(jià)，通過含量測(cè)定分析和干膏率進(jìn)行定量評(píng)價(jià)，綜合以上評(píng)價(jià)方法優(yōu)選煎煮工藝并驗(yàn)證。通過Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法制備17批煎煮樣品，建立了17批樣品HPLC指紋圖譜，標(biāo)定了14個(gè)共有峰，利用多元統(tǒng)計(jì)分析對(duì)指紋圖譜共有峰數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）與正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）并計(jì)算得分，結(jié)果顯示9號(hào)工藝為最佳煎煮工藝，即煎煮2次，第1次加16倍量水，浸泡30 min，煎煮30 min；第2次加16倍量水，煎煮30 min。同時(shí)采用HPLC對(duì)17批樣品進(jìn)行定量分析，對(duì)綠原酸、阿魏酸等6個(gè)指標(biāo)成分進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)合干膏率結(jié)果進(jìn)行綜合評(píng)分，結(jié)果9號(hào)煎煮工藝評(píng)分最高。對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的2種評(píng)價(jià)方法所得結(jié)果一致，通過工藝驗(yàn)證試驗(yàn)最終確定SYD最佳煎煮工藝。利用Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法，結(jié)合“指紋圖譜-多元統(tǒng)計(jì)分析-指標(biāo)成分”多維評(píng)價(jià)的評(píng)控方法，得出的SYD傳統(tǒng)最佳煎煮工藝穩(wěn)定可行，為煎煮工藝不詳?shù)囊活惤?jīng)典名方制劑研發(fā)提供一種研究模式。

四妙勇安湯；經(jīng)典名方；煎煮工藝；指紋圖譜；Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法；主成分分析；正交偏最小二乘法-判別分析；綠原酸；阿魏酸；異綠原酸B；異綠原酸A；異綠原酸C；安格洛苷C；肉桂酸；哈巴俄苷；甘草酸

四妙勇安湯（Simiao Yong’an Decoction，SYD）是國家中醫(yī)藥管理局公布的《古代經(jīng)典名方目錄（第一批）》100首方劑之一，出自清代鮑相璈所著《驗(yàn)方新編》，原書載其方藥組成為“金銀花、元參各三兩，當(dāng)歸二兩，甘草一兩”，作為清熱解毒的代表方劑，全方配伍共奏“清熱解毒、活血止痛”之功，主治熱毒型脫疽，臨床使用具有用量大、效果佳、連續(xù)服用的特點(diǎn)[1]。現(xiàn)代常用于治療血栓閉塞性脈管炎、糖尿病及其并發(fā)癥、動(dòng)脈硬化性閉塞癥、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化心臟病等疾病，療效確切、應(yīng)用廣泛[2-3]，具有良好的臨床應(yīng)用價(jià)值與需求。

經(jīng)典名方制劑開發(fā)最關(guān)鍵的難點(diǎn)之一是古籍記載的煎煮工藝不詳，難以保證開發(fā)的產(chǎn)品與原湯劑原汁原味的傳統(tǒng)功效一致，故經(jīng)典名方制劑研發(fā)以“遵古”為首要原則，2021年4月26日，國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評(píng)中心發(fā)布了《按古代經(jīng)典名方目錄管理的中藥復(fù)方制劑藥學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則（征求意見稿）》（以下簡稱“技術(shù)指導(dǎo)原則”），文件中明確指出“應(yīng)按照國家發(fā)布的古代經(jīng)典名方關(guān)鍵信息及古籍記載，研究、制備基準(zhǔn)樣品”，即遵循“遵古”原則，保證制劑質(zhì)量的一致性及臨床使用的安全有效。

然而遵照SYD古籍記載發(fā)現(xiàn)，原書記載雖指明了處方各藥味的用量，但制備方法的記載僅為“水煎服”，未明確其煎煮工藝的具體參數(shù)，如加水量、煎煮時(shí)間、煎煮次數(shù)等。對(duì)于煎煮工藝的重要性，歷代醫(yī)家早有研究，清代徐靈胎曰：“煎藥之法，最宜深講，藥之效不效，全在乎此”[4-5]?，F(xiàn)代研究也表明，煎藥的加水量、浸泡時(shí)間、煎煮時(shí)間等因素都對(duì)中藥有效成分的溶出有較大影響，以煎煮時(shí)間為例，時(shí)間過短則有效成分溶出不完全；時(shí)間過長易使結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定成分被破壞[6]。煎煮工藝作為經(jīng)典名方制劑開發(fā)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，煎煮工藝不明則無法確保臨床用藥的安全性與有效性，也將阻礙以SYD為代表的經(jīng)典名方的研發(fā)上市進(jìn)程，因此，對(duì)古籍記載不詳?shù)慕?jīng)典名方進(jìn)行煎煮工藝研究十分必要。

基于此，本研究遵循“遵古”原則，采用Box- Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法（Box-Behnken design- response surface methodology，BBD-RSM），整合“指紋圖譜-多元統(tǒng)計(jì)分析-指標(biāo)成分”多維評(píng)價(jià)，綜合指紋圖譜-多元統(tǒng)計(jì)分析定性半定量、指標(biāo)成分-干膏率定量分析結(jié)果，對(duì)SYD煎煮工藝進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)和參數(shù)優(yōu)化，旨在填補(bǔ)SYD制劑研究空白，為SYD后續(xù)的制劑開發(fā)及工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Thermo Dionex UltiMate 3000型高效液相色譜系統(tǒng)，美國Thermo Fisher公司；CPA225D型電子天平，十萬分之一，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；HR/T20M型離心機(jī)，湖南赫西儀器裝備有限公司；AR224CN型電子天平，萬分之一，奧豪斯儀器（常州）有限公司；DZF-6050型真空干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；HH-2型恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司；FTS-10A型煎藥壺，規(guī)格4.5 L，潮州市一壺百飲電器實(shí)業(yè)有限公司；N-1100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海泉杰儀器有限公司；SHB-IIIA型循環(huán)水式真空泵，北京中興偉業(yè)有限公司。

1.2 試藥

藥材金銀花（批號(hào)21070114）、玄參（批號(hào)21060112）、當(dāng)歸（批號(hào)21120112）、甘草（批號(hào)21060103）均購自四川國強(qiáng)中藥飲片股份有限公司。以上藥材均經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定專業(yè)裴瑾教授鑒定，金銀花為忍冬科忍冬屬植物忍冬Thunb.的干燥花蕾或帶初開的花，玄參為玄參科玄參屬植物玄參Hemsl.的干燥根，當(dāng)歸為傘形科當(dāng)歸屬植物當(dāng)歸(Oliv.) Diels的干燥根，甘草為豆科甘草屬植物甘草Fisch.的干燥根及根莖，均符合《中國藥典》2020年版一部相關(guān)項(xiàng)下規(guī)定。對(duì)照品綠原酸（批號(hào)RFS-L007019080 29）、阿魏酸（批號(hào)RFS-A00211812016）、異綠原酸A（批號(hào)RFS-Y06802201024）、異綠原酸B（批號(hào)RFS-Y06911801005）、異綠原酸C（批號(hào)RFS- Y07011805016）、安格洛苷C（批號(hào)RFS-A0160210 5014）、哈巴俄苷（批號(hào)RFS-H02001911019）、肉桂酸（批號(hào)RFS-R00311812016）、甘草酸（批號(hào)RFS-G00402007002）購自成都瑞芬思生物科技有限公司，各對(duì)照品質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%；色譜純乙腈、甲醇、磷酸，購自美國Sigma-Aldrich公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 SYD供試品溶液 參考《中國科學(xué)技術(shù)史·度量衡卷》[7]及我國第一部通史性的度量衡史專著《中國度量衡史》[8]記載的清代度量衡法，可知清代1兩約合今37.30 g，并參考國家中醫(yī)藥管理局、國家藥品監(jiān)督管理局目前公布的7首和25首經(jīng)典名方關(guān)鍵信息表中劑量內(nèi)容，發(fā)現(xiàn)清代方劑中1兩折算劑量均為37.30 g，故確定清代1兩為今37.30 g，得出SYD原方處方量為金銀花、玄參各111.90 g，當(dāng)歸74.60 g，甘草37.30 g。

稱取1/5處方量（金銀花、玄參各22.38 g，當(dāng)歸14.92 g，甘草7.46 g）飲片，各試驗(yàn)號(hào)樣品按表1因素水平進(jìn)行煎煮，合并煎液，減壓濃縮至200 mL，即為SYD樣品溶液。取1 mL SYD樣品溶液，加入1 mL甲醇渦旋3 min，混勻后12 000 r/min離心（離心半徑16 cm）10 min，取上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，即得SYD供試品溶液。

表1 SYD煎煮工藝響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.1.2 混合對(duì)照品溶液 精密稱取綠原酸、阿魏酸、異綠原酸C、安格洛苷C、哈巴俄苷、甘草酸對(duì)照品適量，加入甲醇制成分別含0.90、0.19、0.66、0.38、0.33、0.34 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2 BBD-RSM因素和水平設(shè)計(jì)

基于前期文獻(xiàn)研究[9-12]及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇對(duì)煎煮工藝影響較大的加水量、浸泡時(shí)間、煎煮時(shí)間及煎煮次數(shù)為考察因素，對(duì)于SYD這類古籍記載內(nèi)容中僅為“水煎服”等無詳細(xì)工藝制法表述的經(jīng)典名方，技術(shù)指導(dǎo)原則中明確指出應(yīng)參照《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》并結(jié)合具體情況，合理確定制備工藝。

《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》文件中對(duì)煎煮次數(shù)的要求為“每劑藥一般煎煮兩次，將兩煎藥汁混合后再分裝”，相關(guān)文獻(xiàn)研究也表明煎藥時(shí)藥材內(nèi)外溶液的濃度達(dá)到平衡時(shí)，有效成分不再繼續(xù)溶出，此時(shí)需濾過藥液，藥渣重新加水煎煮，有效成分才能繼續(xù)溶出[13-14]，故依據(jù)相關(guān)文件文獻(xiàn)確定煎煮次數(shù)2次為宜，在此基礎(chǔ)上選取加水量（1）、浸泡時(shí)間（2）、煎煮時(shí)間（3）為考察因素，因素水平見表1，按表1制備得到得17批試驗(yàn)樣品。

2.3 指紋圖譜評(píng)價(jià)研究SYD煎煮工藝

中藥復(fù)方以多成分、多靶點(diǎn)協(xié)同作用發(fā)揮藥效，單一或幾個(gè)成分不能全面反映其整體特征，而中藥指紋圖譜研究具有整體性的特點(diǎn)，隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，指紋圖譜技術(shù)趨于成熟，因其宏觀分析的優(yōu)勢(shì)廣泛應(yīng)用于煎煮工藝評(píng)價(jià)，可對(duì)中藥復(fù)方所含復(fù)雜成分進(jìn)行定性半定量分析[15-17]。

2.3.1 色譜條件 色譜柱為Thermo Hypersil Gold C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈- 0.4%磷酸水溶液，梯度洗脫：0～3 min，0～5%乙腈；3～18 min，5%～11%乙腈；18～45 min，11%～20%乙腈；45～60 min，20%～33%乙腈；60～70 min，33%～50%乙腈；70～75 min，50%～5%乙腈；體積流量1 mL/min；柱溫38 ℃；進(jìn)樣量5 μL；檢測(cè)波長273 nm[18]。

2.3.2 精密度試驗(yàn) 取1號(hào)試驗(yàn)樣品，按照“2.1.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行檢測(cè)，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算各共有峰保留時(shí)間和峰面積的RSD均小于2%，表明本方法精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取1號(hào)試驗(yàn)樣品，按照“2.1.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件下，分別在供試品溶液制備后0、4、8、12、16、24、48 h進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算各共有峰保留時(shí)間和峰面積的RSD均小于2%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取1號(hào)試驗(yàn)樣品，按照“2.1.1”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液，共6份，計(jì)算各共有峰保留時(shí)間和峰面積RSD均小于2%，表明方法重復(fù)性良好。

2.3.5 指紋圖譜分析 將所得17批樣品色譜圖導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012 版）”進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，選擇特征明顯、重復(fù)性好、穩(wěn)定性好的14個(gè)色譜峰為共有峰，14個(gè)共有峰中指認(rèn)出9個(gè)成分，分別是峰4（綠原酸）、6（阿魏酸）、8（異綠原酸B）、9（異綠原酸A）、10（異綠原酸C）、11（安格洛苷C）、12（肉桂酸）、13（哈巴俄苷）、14（甘草酸）。記錄各樣品色譜圖及峰面積數(shù)據(jù)，結(jié)果見圖1和表2。

2.3.6 指紋信息多元統(tǒng)計(jì)分析 將17批不同煎煮工藝樣品共有峰峰面積標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)，導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）處理。PCA結(jié)果顯示，17批不同煎煮工藝樣品可分為2類，S4、S10～S12、S15為一類，其余樣品為另一類（圖2-A）。OPLS-DA得分矩陣圖可知（圖2-B），17批樣品數(shù)據(jù)分成2類，分類結(jié)果與PCA一致。載荷散點(diǎn)圖上點(diǎn)距離原點(diǎn)越遠(yuǎn)（圖2-C），表明對(duì)樣本的區(qū)分能力越強(qiáng)。

為進(jìn)一步篩選出對(duì)上述樣本分類貢獻(xiàn)較大的成分，結(jié)合變量投影重要性（variable importance in project，VIP）可更直觀地看出各色譜峰的影響程度，VIP值＞1.0為有意義變量。結(jié)果表明，共有8個(gè)色譜峰的VIP值＞1（圖2-D），依次為峰1、7、12、3、9、11、5、13，說明這8種成分可能是將17批樣品分為2類的差異性成分，結(jié)果表明不同煎煮工藝樣品間成分存在差異。

4-綠原酸 6-阿魏酸 8-異綠原酸B 9-異綠原酸A 10-異綠原酸C 11-安格洛苷C 12-肉桂酸 13-哈巴俄苷 14-甘草酸

表2 不同煎煮工藝SYD樣品色譜峰峰面積

A-PCA得分圖 B-OPLS-DA得分矩陣 C-OPLS-DA載荷散點(diǎn)圖 D-OPLS-DA的VIP值

2.3.7 PCA計(jì)算不同煎煮工藝樣品得分 在多元統(tǒng)計(jì)分析明確煎煮樣品具有差異的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)指紋圖譜共有峰數(shù)據(jù)進(jìn)行分析計(jì)算，以綜合評(píng)分結(jié)果對(duì)17批煎煮工藝進(jìn)行評(píng)價(jià)，將指紋圖譜的14個(gè)共有峰峰面積導(dǎo)入SPSS 20.0軟件，進(jìn)行PCA處理。以主成分特征值＞1為提取標(biāo)準(zhǔn)，共提取出3個(gè)主成分，3個(gè)主成分的累積方差貢獻(xiàn)率為88.909%，故選取前3個(gè)主成分進(jìn)行評(píng)價(jià)（表3）。

以提取的3個(gè)主成分的因子得分乘以相應(yīng)的方差算數(shù)平方根得到3個(gè)主成分的得分，即主成分1得分（1）＝主成分1因子得分×初始特征值的算數(shù)平方根，以此類推得到主成分2、3得分（2、3）。按照公式＝0.682 9211＋0.216 0192＋0.101 0603分別計(jì)算17個(gè)樣品的綜合得分值，得分結(jié)果顯示（表4），9號(hào)煎煮工藝為最佳工藝（即加16倍量水，浸泡30 min，煎煮30 min，煎煮2次）。

表3 主成分因子的特征值和方差貢獻(xiàn)率

*提取平方和載入的主成分

* select the principal component loaded by the sum of squares

表4 主成分綜合得分排序

2.4 指標(biāo)成分含量及干膏率評(píng)價(jià)SYD煎煮工藝

采用指紋圖譜定性半定量分析對(duì)17批煎煮樣品的指紋數(shù)據(jù)進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析計(jì)算，得到最佳煎煮工藝為9號(hào)。指紋圖譜分析具有整體性和模糊性的特點(diǎn)，較全面地反映了復(fù)方所含化學(xué)成分，但未對(duì)深入到定量分析層面，目前，關(guān)于復(fù)方研究也常通過指紋圖譜結(jié)合定量測(cè)定進(jìn)行研究，故為更加合理科學(xué)的評(píng)價(jià)SYD煎煮工藝，在指紋圖譜分析的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用HPLC法對(duì)SYD中6個(gè)指標(biāo)成分進(jìn)行含量測(cè)定，指標(biāo)成分的選擇綜合考慮君臣佐使關(guān)系、色譜分離度及與藥效作用相關(guān)等因素，最終確定色譜分離度好且與藥效密切相關(guān)的綠原酸、阿魏酸、異綠原酸C、安格洛苷C、哈巴俄苷、甘草酸6個(gè)指標(biāo)成分，結(jié)合含量測(cè)定和干膏率結(jié)果計(jì)算煎煮工藝得分，從定量分析角度對(duì)工藝進(jìn)行評(píng)價(jià)，綜合2種評(píng)分方法所得結(jié)果，最終確定最佳煎煮工藝。

2.4.1 色譜條件 同“2.3.1”項(xiàng)。

2.4.2 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 分別吸取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液各5 μL，注入液相色譜儀，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各色譜峰分離度、拖尾因子和理論板數(shù)均較好，典型色譜圖見圖3。

1-綠原酸 2-阿魏酸 3-異綠原酸C 4-安格洛苷C 5-哈巴俄苷 6-甘草酸

2.4.3 線性關(guān)系考察 分別精密量取“2.1.2”項(xiàng)下制備的對(duì)照品溶液各1 mL，用甲醇通過2倍稀釋法分別稀釋2、4、8、16、32倍，制得各質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，分別按照“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），峰面積為縱坐標(biāo)（）進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程、相關(guān)系數(shù)（2）和線性范圍分別為綠原酸＝0.183 1＋0.039 9，2＝0.999 3，線性范圍14.06～900.00 μg/mL；阿魏酸＝0.248 6－0.048 6，2＝0.999 2，線性范圍2.92～186.67 μg/mL；異綠原酸C＝0.169 8－0.878 5，2＝0.999 7，線性范圍10.36～663.33 μg/mL；安格洛苷C＝0.115 5＋0.050 0，2＝0.999 5，線性范圍5.94～380.00 μg/mL；哈巴俄苷＝0.119 0＋0.114 7，2＝0.999 4，線性范圍5.13～328.33 μg/mL；甘草酸＝0.013 6－0.137 9，2＝0.999 7，線性范圍5.31～340.00 μg/mL。

2.4.4 精密度試驗(yàn) 取“2.1.2”項(xiàng)下配制的對(duì)照品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄綠原酸、阿魏酸、異綠原酸C、安格洛苷C、哈巴俄苷、甘草酸色譜峰面積。結(jié)果6個(gè)成分峰面積的RSD分別為1.54%、0.81%、1.11%、1.72%、1.77%、1.13%，表明儀器精密度符合要求。

2.4.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取SYD樣品溶液（S1），按“2.1.1”項(xiàng)下方法平行制備SYD供試品溶液6份，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄綠原酸、阿魏酸、異綠原酸C、安格洛苷C、哈巴俄苷、甘草酸色譜峰面積。結(jié)果6個(gè)成分質(zhì)量濃度的RSD分別為0.59%、1.39%、0.20%、0.39%、1.45%、1.06%，結(jié)果表明本方法重復(fù)性符合要求。

2.4.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取SYD供試品溶液（S1），按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件，分別于制備后0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，進(jìn)樣6次，分別記錄綠原酸、阿魏酸、異綠原酸C、安格洛苷C、哈巴俄苷、甘草酸色譜峰面積。結(jié)果6個(gè)成分峰面積的RSD分別為1.58%、1.71%、1.38%、0.52%、0.68%、0.90%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.4.7 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取已知指標(biāo)成分含量的SYD樣品溶液（S1）1 mL，分別按樣品中各成分含量的100%水平每份加入綠原酸、阿魏酸、異綠原酸C、安格洛苷C、哈巴俄苷、甘草酸對(duì)照品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下方法平行制備6份SYD供試品溶液進(jìn)行含量測(cè)定，計(jì)算6種指標(biāo)成分的加樣回收率及RSD值，結(jié)果6種成分各自平均加樣回收率分別為100.29%、101.41%、99.13%、100.12%、99.88%、96.68%，RSD分別為0.66%、1.52%、0.23%、0.42%、1.18%、1.62%，表明該方法加樣回收率符合要求。

2.4.8 干膏率的測(cè)定 量取17批不同煎煮工藝的SYD湯液50 mL，放于已恒定質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，100 ℃水浴鍋上蒸干后，放入烘箱105 ℃干燥至恒定質(zhì)量，計(jì)算煎液干膏率。

干膏率＝煎液干膏質(zhì)量/飲片投料量

2.4.9 多指標(biāo)含量測(cè)定評(píng)價(jià)結(jié)果 計(jì)算各指標(biāo)性成分含量測(cè)定結(jié)果，綜合評(píng)分設(shè)定滿分為100分，根據(jù)君臣佐使關(guān)系劃分君藥金銀花中成分：綠原酸、異綠原酸C權(quán)重系數(shù)分別為20，臣藥玄參中成分：安格洛苷C、哈巴俄苷權(quán)重系數(shù)分別為15，佐藥當(dāng)歸及使藥甘草中成分：阿魏酸、甘草酸權(quán)重系數(shù)分別為10，干膏率權(quán)重系數(shù)為10。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行總加權(quán)評(píng)分[19-20]，綜合評(píng)分＝綠原酸/綠原酸max×20＋阿魏酸/阿魏酸max×10＋異綠原酸C/異綠原酸C max×20＋安格洛苷C/安格洛苷C max×15＋哈巴俄苷/哈巴俄苷max×15＋甘草酸/甘草酸max×10＋干膏/干膏max×10，綜合評(píng)分結(jié)果見表5，結(jié)果顯示，9號(hào)煎煮工藝為最佳工藝，與指紋圖譜綜合評(píng)分結(jié)果相同。

2.5 BBD-RSM回歸模型的建立及方差分析

采用Design Expert 10軟件，通過響應(yīng)面法進(jìn)行工藝優(yōu)化。分別對(duì)各因素水平進(jìn)行多元線性和非線性回歸，建立各指標(biāo)綜合評(píng)分（）對(duì)3個(gè)因素（1、2、3的2次回歸模型方程＝88.15＋2.901－1.832－3.343＋0.3512＋4.9213＋5.5623－5.5612＋2.8222－3.7132。模型的值為0.004 6＜0.01，失擬項(xiàng)值為0.793 3＞0.05，對(duì)模型有利，無失擬因素存在，說明該模型擬合度良好，試驗(yàn)誤差小，可用此模型對(duì)綜合評(píng)分進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。方差分析結(jié)果見表6，自變量1次項(xiàng)1、3，2次項(xiàng)13、12顯著（＜0.05）；自變量2次項(xiàng)23、12極顯著（＜0.01），表明模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各因素對(duì)綜合評(píng)分的影響順序?yàn)?＞1＞2。通過等高線的形狀反映交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，橢圓表示交互作用強(qiáng)，圓形則交互作用較弱，結(jié)果見圖4。

表5 SYD煎煮工藝響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)綜合評(píng)分結(jié)果

模型擬合結(jié)果為加水量15.931倍、浸泡時(shí)間30.238 min、煎煮時(shí)間為武火沸騰后轉(zhuǎn)文火36.497 min。依據(jù)模型擬合結(jié)果和實(shí)際操作最終確定SYD煎煮工藝為加16倍量水，浸泡30 min，煎煮30 min，煎煮2次。采用HPLC對(duì)指標(biāo)成分進(jìn)行含量測(cè)定，綜合干膏率結(jié)果表明9號(hào)煎煮工藝最優(yōu)，與指紋圖譜分析結(jié)果一致，2種評(píng)價(jià)方法從定性與定量的角度，科學(xué)合理地說明了加16倍量水，浸泡30 min，煎煮30 min，煎煮2次的煎煮工藝合理最優(yōu)。

表6 方差分析結(jié)果

圖4 3因素對(duì)綜合評(píng)分的響應(yīng)面圖

2.6 工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

選擇最佳煎煮工藝條件進(jìn)行3批驗(yàn)證試驗(yàn)，按上述方法進(jìn)行含量測(cè)定，計(jì)算得到3批驗(yàn)證樣品含量測(cè)定的綜合得分分別為97.560、97.730、97.390，預(yù)測(cè)值為97.43（表7），基本吻合，說明優(yōu)化得到的煎煮工藝條件較為穩(wěn)定，具備可行性，即SYD最佳煎煮工藝為煎煮2次，第1次加16倍量水，浸泡30 min，煎煮30 min；第2次加16倍量水，煎煮30 min。

表7 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

本研究基于“遵古”理念，以現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范為參照，銜接古籍記載和現(xiàn)行規(guī)范，建立了以“指紋圖譜-多元統(tǒng)計(jì)分析”和“指標(biāo)成分含量-出膏率”為評(píng)價(jià)方式的煎煮工藝研究模式，確定以加水量、浸泡時(shí)間、煎煮時(shí)間作為關(guān)鍵工藝參數(shù)，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)優(yōu)化經(jīng)典名方SYD煎煮工藝。所建立的綜合評(píng)價(jià)研究模式，結(jié)合了指紋圖譜-多元統(tǒng)計(jì)定性半定量分析、指標(biāo)成分-干膏率定量分析2種評(píng)價(jià)方式優(yōu)選最佳工藝，既包含了指紋圖譜分析整體全面的優(yōu)點(diǎn)，又結(jié)合了指標(biāo)成分定量測(cè)定彌補(bǔ)指紋圖譜分析的不足，2種評(píng)價(jià)方式相輔相成，共同解決了SYD古籍記載煎煮工藝不詳?shù)年P(guān)鍵問題，為這一類經(jīng)典名方制劑的研發(fā)提供了一種科學(xué)合理的研究模式，具有一定參考應(yīng)用價(jià)值。

中藥復(fù)方具有多成分、多靶點(diǎn)、多層次的特點(diǎn)，單一指標(biāo)不能全面整體地反映復(fù)方特征，多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)可綜合多項(xiàng)重要指標(biāo)，較單一指標(biāo)評(píng)價(jià)更具優(yōu)勢(shì)，可對(duì)煎煮工藝進(jìn)行更加科學(xué)合理地評(píng)價(jià)，進(jìn)而優(yōu)選得到最佳工藝，保障制劑質(zhì)量及臨床用藥的安全有效[21-22]。故本研究首先利用指紋圖譜整體描述不同煎煮工藝樣品成分情況，指紋圖譜包含化學(xué)信息量大，可較充分地反映出中藥復(fù)雜混合體系中主要功效成分整體狀況[23-24]，再利用PCA、OPLS- DA多元統(tǒng)計(jì)分析樣品指紋圖譜數(shù)據(jù)，建立相關(guān)模型計(jì)算得分，確定最佳煎煮工藝；為彌補(bǔ)指紋圖譜分析模糊及半定量的不足，進(jìn)一步選取功效相關(guān)的6個(gè)重要指標(biāo)成分進(jìn)行含量測(cè)定及出膏率研究，再次對(duì)工藝進(jìn)行評(píng)價(jià)，綜合2次評(píng)價(jià)結(jié)果最終確定SYD最佳煎煮工藝為加水量16倍，浸泡30 min，煎煮30 min，同時(shí)通過驗(yàn)證試驗(yàn)說明該工藝條件較為穩(wěn)定可行。

SYD功效的指標(biāo)成分的選擇是本研究的主要環(huán)節(jié)，基于《中國藥典》2020年版含測(cè)指標(biāo)成分及文獻(xiàn)報(bào)道有效成分，結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果綜合考慮，從方劑君臣佐使關(guān)系入手選取綠原酸、阿魏酸、異綠原酸C、安格洛苷C、哈巴俄苷、甘草酸6個(gè)成分作為含測(cè)指標(biāo)成分，其中綠原酸、異綠原酸C、阿魏酸、哈巴俄苷、甘草酸均為《中國藥典》2020年版中金銀花、玄參、當(dāng)歸、甘草規(guī)定含測(cè)指標(biāo)成分。綠原酸作為君藥金銀花中主要有效成分，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)其具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用[25]。

異綠原酸C為君藥金銀花所含酚酸類成分之一，具有良好的抗炎作用[26]，可抑制多種炎癥因子釋放，是SYD治療心血管系統(tǒng)疾病的重要有效成分。阿魏酸具有抗氧化和抗炎效果[27]，且抗血栓效果突出，能明顯抑制血小板聚集，控制血栓素的釋放[28]。安格洛苷C是玄參中苯丙素苷類代表性成分，在玄參藥材中含量較高，可作為其質(zhì)量控制指標(biāo)之一[29]，安格洛苷C還具有抗血小板聚集作用，是SYD治療動(dòng)脈粥樣硬化的物質(zhì)基礎(chǔ)，與玄參的抗炎活性也密切相關(guān)[30-31]。玄參中環(huán)烯醚萜類成分哈巴俄苷能夠減輕細(xì)胞膜損傷，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的產(chǎn)生；還能發(fā)揮保肝及增強(qiáng)免疫的作用[32-33]。甘草酸是甘草中最重要的有效成分之一，具有抗病毒、抗炎殺菌、抗腫瘤及抗心肌缺血的作用[34]。

綜上，本研究結(jié)果補(bǔ)充了SYD古籍記載煎煮工藝的空白，為SYD的后續(xù)復(fù)方制劑研究奠定基礎(chǔ)，也可為其他古籍煎煮工藝記載不詳?shù)慕?jīng)典名方研究提供一定參考與借鑒。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Optimization of decocting process of Simiao Yong’an Decoction by Box-Behnken design-response surface methodology

ZHANG Xing1, LAI Wen-jing1, LIN Xia1, HUANG You1, YANG Sha-sha1, HAO Yi-wen1, ZHOU Jing-wei1, FU Chao-mei1, HU Chang-jiang1, DONG Yan1, GENG Fu-neng1, ZHANG Zhen1, 2

1. State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China 2. Key Laboratory of Quality Control and Efficacy Evaluation of Traditional Chinese Medicine Formula Granules, Sichuan New Green Pharmaceutical Technology Development Co., Ltd., Pengzhou 610031, China

Following the basic principle of traditional Chinese medicine inheritance, innovation and development – “the principle of following the ancient”, the decocting process of the classic famous recipe Simiao Yong’an Decoction (四妙勇安湯, SYD) was investigated to ensure the original decoction’s original traditional efficacy, and the quality was comprehensively evaluated to provide reference for the further preparation development of the classic famous recipe SYD.Box-Behnken design-response surface method was used to investigate the amount of water added, soaking time and cooking time. Qualitative and semi-quantitative evaluation was carried out through fingerprint analysis combined with multivariate statistical analysis, and quantitative evaluation was carried out through content determination analysis and dry paste rate, and the above evaluation methods were integrated to optimize the decocting process and verify.A total of 17 batches of decocting samples were prepared by Box-Behnken design- response surface method, and HPLC fingerprints of 17 batches of samples were established, and 14 common peaks were calibrated. Multivariate statistical analysis was used to perform principal component analysis (PCA) and orthogonal partial least squares- discriminant analysis (OPLS-DA) on the common peak data of fingerprint, and the scores were calculated. The results showed that No. 9 was the best decocting process, that is, decocting for two times, adding 16 times of water to the first time, soaking for 30 min, decocting for 30 min; Add 16 times amount of water for the second time and cook for 30 min. At the same time, 17 batches of samples were quantitatively analyzed by HPLC, and six index components such as chlorogenic acid and ferulic acid were determined. Combined with the results of dry paste rate, the score of No. 9 decocting process was the highest. The results obtained by the two evaluation methods were consistent, and the best decocting technology of SYD was finally determined through the process verification test.By using Box-Behnken design-response surface method, combined with the multidimensional evaluation and control method of “fingerprint-multivariate statistical analysis-index components”, the optimal traditional decocting process of SYD was stable and feasible, which provided a research model for the development of a class of classic famous recipes with unknown decocting process.

Simiao Yong’an Decoction; classic famous recipe; decocting process; fingerprint pattern; Box-Behnken design-response surface method; principal component analysis; orthogonal partial least squares-discriminant analysis; chlorogenic acid; ferulic acid; isochlorogenic acid B; isochlorogenic acid A; isochlorogenic acid C; angoroside C; cinnamic acid; harpagoside; glycyrrhizic acid

R283.6

A

0253 - 2670(2023)10 - 3109 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.10.008

2022-11-07

國家自然科學(xué)基金青年基金資助項(xiàng)目（81803742）；四川省科技計(jì)劃重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目（2020YFS0567）；四川省科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目（2021YJ0251）；四川省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥科研專項(xiàng)（2021MS109）；四川省教育廳自然科學(xué)重點(diǎn)項(xiàng)目（18ZA0187）；成都中醫(yī)藥大學(xué)杏林學(xué)者青年學(xué)者專項(xiàng)（QNXZ2019031）；成都中醫(yī)藥大學(xué)杏林學(xué)者學(xué)科人才科研提升計(jì)劃項(xiàng)目（XLXZ2022012）；四川新綠色藥業(yè)博士后科研專項(xiàng)（301022019）

張 星（1998—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幮轮苿┖托聞┬脱芯俊-mail: 2381225006@qq.com

張 臻，女，博士，副教授，從事中藥制劑新技術(shù)和新劑型研究。E-mail: zhangzhendr@126.com

耿福能，男，博士，教授，從事中藥新制劑與新劑型研究。E-mail: haoyishenggfn1956@126.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]