◎ 姜雯雯，陳曉燕，曾 威，馬丹丹，熊茫茫，付樂(lè)勝

（江西科技學(xué)院，江西 南昌 330098）

隨著耐藥結(jié)核菌株的出現(xiàn)，開(kāi)發(fā)新的藥物對(duì)抗耐藥結(jié)核菌株感染顯得尤為重要，而抗菌肽作為“天然抗生素”有很大的開(kāi)發(fā)潛力[1]?？咕腫2-4]屬于生物活性肽，具有廣譜抗菌性、種類(lèi)較多、抗菌活性較高、無(wú)污染及無(wú)使用殘留的顯著優(yōu)勢(shì)。生物活性肽[5]基于其食源性的特點(diǎn)，且具有無(wú)毒、低過(guò)敏性、高安全性等優(yōu)點(diǎn)，因此，抗菌肽在抗生素耐藥、美容領(lǐng)域以及抗腫瘤治療方面有較大的研究開(kāi)發(fā)價(jià)值和應(yīng)用前景。目前，雖有對(duì)水產(chǎn)生物蝦抗菌肽的研究，但主要集中在對(duì)南極磷蝦整蝦或蝦粉的研究，對(duì)蝦殼、蝦仁分開(kāi)研究較少。因此，本課題選取基圍蝦作為食源性抗菌肽的研究對(duì)象，對(duì)蝦殼抗菌肽進(jìn)行比較研究，充分利用蝦殼這種高產(chǎn)的下腳料，以期創(chuàng)造更大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)試劑與儀器

蝦殼來(lái)源菜市場(chǎng)新鮮的基圍蝦；胰蛋白酶（≥50000 U·g-1）購(gòu)于Thermo Fisher Scientif ic；甲醛、氫氧化鈉等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。高速離心機(jī)(TDL-60B)，購(gòu)于上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)；pH 機(jī)（DDS-307），購(gòu)于上海儀電科學(xué)儀器有限公司；恒溫水浴鍋(HH-6)，購(gòu)于上海皓莊儀器有限公司；堿式滴定管(Ex20)，購(gòu)于廣州天博化玻儀器有限公司；Milli-Q 超純水機(jī)，購(gòu)于美國(guó) Millipore 公司。

1.2 試驗(yàn)內(nèi)容

1.2.1 響應(yīng)面因素水平設(shè)計(jì)

根據(jù)文獻(xiàn)，以酶解溫度、酶解時(shí)間、初始pH 值作為對(duì)酶解效果的三因素，利用Box-Behnken 設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，將酶解液中氨基氮含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，建立二次響應(yīng)面分析模型圖，對(duì)酶解工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，響應(yīng)面優(yōu)化因素與水平見(jiàn)表1。試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用 Design-Experpt10.0.0 和Excel97-2013 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表

1.2.2 酶解試驗(yàn)

以整蝦殼粉為原材料，選取胰蛋白酶作為酶解的生物酶，配置50 mL 的酶解液，其中，酶解液濃度為8.0%，在不同的酶解條件下（酶解溫度、酶解時(shí)間、初始pH 值)進(jìn)行酶解，隨后將酶解液于100 ℃下水浴加熱10 min，終止酶解反應(yīng)，冷卻至室溫，于離心機(jī)8 000 r·min-1條件下5 ℃離心分離10 min，收集上清液，以酶解液中氨基氮含量為指標(biāo)，采用甲醛電位滴定法測(cè)定各酶解液中氨基氮含量，比較酶解效果。

1.2.3 蝦殼中氨基氮含量的測(cè)定

取基圍蝦蝦殼，并制成蝦粉，采用甲醛電位滴定法，利用式（1）計(jì)算蝦殼中氨基氮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。在測(cè)定氨基氮含量之前，需將所得酶解液放置100 ℃的水浴中10 min 終止酶解反應(yīng)。取酶解溶液15 mL，用0.05M NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 至8.2，隨后加5 mL 甲醛溶液，再用NaOH 溶液調(diào)pH 值至9.2，記錄NaOH 消耗量為V1，以純化水作為對(duì)照組，同樣操作調(diào)pH 值至9.2并記錄消耗量為V2。利用式（1）計(jì)算氨基氮含量：

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果

以酶解溫度（A）、酶解時(shí)間（B）、初始pH（C）為自變量，氨基氮含量（R）為響應(yīng)值，通過(guò)Box-Behnken 進(jìn)行17 次響應(yīng)面分析試驗(yàn)，優(yōu)化酶解提取抗菌肽工藝。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果表

2.2 回歸模型分析

使用Design-Expert 對(duì)表2 中的響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合統(tǒng)計(jì)，并對(duì)回歸模型進(jìn)行誤差分析、可信度分析。表3 為回歸模型的方差分析及顯著性試驗(yàn)表。由表3 可知：該模型的P 值＜0.000 1，模型整體達(dá)到極顯著水平。失擬項(xiàng)P 值0.277 0＞0.05 不顯著，表示該模型與純誤差關(guān)聯(lián)不顯著，模型比較穩(wěn)定，F(xiàn)值1.86 表明該模型合理。一次項(xiàng)A、B、C，交互項(xiàng)AC、BC 及二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)酶提取效果極顯著，交互項(xiàng)AB 對(duì)酶解結(jié)果影響不顯著。

表3 回歸模型的方差分析及顯著性試驗(yàn)表

表4 為回歸方程的可信度分析表。表4 中顯示該模型的變異系數(shù)CV＜40%，表明試驗(yàn)設(shè)計(jì)可信度和精確度比較高。模型的校正決定系數(shù)R2＝0.996 0，表明不到1% 的響應(yīng)面變異無(wú)法利用該模型解釋?zhuān){(diào)整后的決定系數(shù)Adjusted R2 ＝0.990 9、預(yù)測(cè)擬合度Predicted R2＝0.960 3，說(shuō)明該回歸模型誤差較小、擬合度較好。通過(guò)分析可知：該響應(yīng)面試驗(yàn)是可行的，該模型能夠較好地對(duì)抗菌肽酶解條件進(jìn)行優(yōu)化。

表4 回歸方程的可信度分析表

所得數(shù)據(jù)經(jīng)回歸擬合得二次多項(xiàng)回歸方程：

2.3 響應(yīng)曲面分析

圖1 為各影響因素交互作用對(duì)氨基氮含量影響的響應(yīng)面圖。從圖1（a）可知，當(dāng)酶解時(shí)間不變時(shí)，氨基氮含量隨著酶解溫度的升高先增加，達(dá)到一定值后逐漸下降；而在酶解溫度不變的條件下，隨著酶解時(shí)間的升高，氨基氮含量先升高，達(dá)到極大值后急劇下降，表明在一次項(xiàng)中酶解時(shí)間比酶解溫度對(duì)氨基氮的影響更顯著。從圖1（b）可看出，氨基氮含量隨著初始pH 和酶解溫度的升高都表現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)，但可以看出初始pH 對(duì)酶解效果的影響更大些。從圖1（c）可知，在一次項(xiàng)中初始pH 比酶解時(shí)間對(duì)氨基氮含量的影響更大且交互作用顯著。

使用Design-Experpt 數(shù)據(jù)軟件優(yōu)化分析功能，在基礎(chǔ)試驗(yàn)性因素下取得范圍內(nèi)氨基氮含量的響應(yīng)值最大值，從中得到的最佳條件為：酶解溫度44.565 ℃，酶解時(shí)間8.531 h，pH 為7.888，此時(shí)預(yù)測(cè)得出酶解液中氨基氮含量的最大值為16.536 mg·g-1。為實(shí)際生產(chǎn)的可行性，選取最優(yōu)酶解條件為：酶解溫度44.5 ℃，酶解時(shí)間8.5 h，pH 為7.9，在此條件下重復(fù)試驗(yàn)3 次，實(shí)際測(cè)得的氨基氮為（15.98±0.95） mg·g-1。理論預(yù)測(cè)值與實(shí)際值接近，重復(fù)性好，說(shuō)明響應(yīng)面法優(yōu)化抗菌肽酶解工藝是可行的。

3 討論

食源性生物活性肽的來(lái)源范圍在逐漸擴(kuò)大，隨著人們對(duì)更多海洋生物活性物質(zhì)的深入研究，其在抗生素耐藥、美容領(lǐng)域以及抗腫瘤治療方面的研究與應(yīng)用前景越來(lái)廣闊。本課題選取基圍蝦殼進(jìn)行食源性抗菌肽的研究，充分利用蝦殼這種高產(chǎn)低值的下腳料，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面優(yōu)化基圍蝦酶解工藝，獲得最優(yōu)提取條件為：酶解溫度44.5 ℃，酶解時(shí)間8.5 h，pH 為7.9，此時(shí)酶解液中氨基氮含量為（15.98±0.95） mg·g-1，與模型理論預(yù)測(cè)值16.536 mg·g-1基本一致，旨在為后續(xù)基礎(chǔ)研究和工業(yè)生產(chǎn)提供理論依據(jù)和實(shí)踐指導(dǎo)，實(shí)現(xiàn)基圍蝦資源高附加值利用。