范志平，陳紅霞，兌靖冬，范子瑋，張娟娟，謝 勇，聶 立

（1. 宜賓市食品藥品檢驗檢測中心，四川宜賓 644600；2. 四川省藥品監(jiān)督管理局中藥質(zhì)量控制重點實驗室，四川 宜賓 644600；3. 銅仁學(xué)院 材料與化學(xué)工程學(xué)院，貴州 銅仁 554300）

0 引言

苦丁茶屬于冬青科冬青屬植物，又稱茶丁、富丁茶、皋盧茶等。主要分布在我國西南地區(qū)及華南地區(qū)。其成品茶清香有苦味，具有清熱消暑、生津止渴、健胃消積、預(yù)防炎癥等保健功能，目前苦丁茶已成為人們?nèi)粘Ｉ钪械囊环N天然植物飲料[1-8]。

孔雀石綠別名孔雀綠、堿基綠，是一種三苯甲烷類綠色染料，曾用于制陶、印染、皮革、生物染色等方面，由于其具有有效的殺菌效果，曾被用來預(yù)防和治療水產(chǎn)品真菌或細菌感染，但對人體會產(chǎn)生極大的危害性，具有致癌、致畸和致突變的作用，同時孔雀石綠在水產(chǎn)品物內(nèi)可代謝為隱色孔雀石綠，其毒性更大[9-16]。鑒于此，許多國家已經(jīng)將孔雀石綠及其代謝物列為水產(chǎn)養(yǎng)殖的禁用藥物，我國在2019 年發(fā)布《農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第250 號》明確規(guī)定，孔雀石綠屬于食品動物中禁止使用的藥品及其他化合物[17-18]。目前，國家現(xiàn)有標準和國內(nèi)外文獻關(guān)于孔雀石綠分析檢測的品種主要有養(yǎng)殖水體、水產(chǎn)品、飼料和淀粉制品[19-27]。

近年來，在市場監(jiān)管部門送檢的苦丁茶中發(fā)現(xiàn)有不法人員使用孔雀石綠對其進行染色，使其顏色更加鮮綠誘人，以謀取不法利益。但目前國家標準及國內(nèi)外文獻都沒有高效液相色譜法測定苦丁茶中孔雀石綠及其代謝物，因此需要建立一種準確度好、靈敏度高的方法測定苦丁茶中的孔雀石綠及其代謝物的含量，可以更好地為市場品監(jiān)管部門嚴厲打擊苦丁茶中非法添加孔雀石綠提供有利的技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260 型高效液相色譜儀（配備四元泵、柱溫箱、自動進樣器、配紫外-可見光檢測器），美國安捷倫公司產(chǎn)品；電子天平，METTLER TOLEDO；渦旋振蕩器，MX-S SciloGEX；高速離心機，四川蜀科儀器有限公司產(chǎn)品；TSC-II 型氮吹儀，廣州泰思科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；pH 計（PHSJ-4A），上海雷磁產(chǎn)品。

固相萃取柱：MCX 陽離子交換柱，60 mg/3 mL；孔雀石綠標準儲備液（100 μg/mL，1.0 mL）、隱色孔雀石綠標準儲備液（100 μg/mL，1.0 mL），農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研檢測所提供。

樣品為市場購買的苦丁茶，將樣品混勻后用料理機粉碎，過20 目篩，密封，作為試樣。陰性樣品為市售樣品中篩選出不含待測組分的試樣；陽性樣品為市售樣品中篩選出含待測組分的試樣。

1.2 標準溶液配制

混合標準中間液（孔雀石綠1 μg/mL；隱色孔雀石綠3 μg/mL）：分別準確吸取孔雀石綠標準儲備液0.10 mL、隱色孔雀石綠標準儲備液0.30 mL 置于同一個10 mL 容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，配制成混合標準中間液，-18 ℃下避光保存。

混合基質(zhì)標準溶液的制備：稱取5 份均質(zhì)混勻的空白基質(zhì)各2 g（精確至0.001 g） 置于50 mL 具塞塑料離心管中，加入混合標準中間液30，60，120，240，360，600 μL，加入10 mL 2%乙酸水溶液，渦旋混勻，浸泡30 min，余下操作同樣品處理。

1.3 樣品處理

準確稱取2 g（精確至0.001 g） 試樣置于50 mL具塞塑料離心管中，加入10 mL 2%乙酸水溶液，渦旋混勻，浸泡30 min。加入10 mL 2%乙酸乙腈溶液，混勻，于渦旋振蕩器上渦旋1 min，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min 離心4 min，取上清液轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中，重復(fù)上述操作提取2 次，提取液置同一容量瓶中，用2%乙酸乙腈溶液定容至刻度，搖勻，準確吸取10 mL 置于玻璃氮吹管中，于45 ℃下氮吹至約2 mL，待凈化。

凈化：將上述溶液以低于1.0 mL/min 的流速加載在固相萃取小柱上，再依次用2 mL 水、2 mL 2%甲酸水溶液和2 mL 甲醇淋洗小柱，棄去淋洗液，真空抽干2 min，用3 mL 5%氨水甲醇溶液進行洗脫，收集洗脫液至玻璃氮吹管。洗脫液在45 ℃下氮氣流吹干，加入2 mL 2%乙酸乙腈溶液溶解殘渣，樣液過0.22 μm 濾膜后，供液相色譜儀測定。

1.4 液相色譜分析條件

液相色譜柱：Thermo Hypersil GOLD C18（4.6 mm×250 mm，5 μm） 色譜柱；柱后氧化柱規(guī)格35 mm×4.6 mm，填料類型為硅藻土∶二氧化鉛=3∶1。

流動相：(A)20 mmol/L 乙酸銨溶液（pH 值4.5），(B)乙腈，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量50 μL，檢測波長618 nm。

梯度洗脫參考條件見1。

表1 梯度洗脫參考條件

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品提取是否加水浸泡的優(yōu)化

考慮到孔雀石綠與隱色孔雀石綠均為弱堿性化合物，為了提高待測組分的提取效率，試樣初步采用含酸乙腈溶液提取。試驗考查了不加水浸泡2%乙酸乙腈提取、加水浸泡后再用2%乙酸乙腈提取、加入2%乙酸水浸泡后再用純乙腈提取，以及加入2%乙酸水浸泡后再用2%乙酸乙腈提取4 種方式浸泡陽性樣品。

樣品提取是否加水浸泡的優(yōu)化結(jié)果見圖1。

圖1 樣品提取是否加水浸泡的優(yōu)化結(jié)果

試驗結(jié)果表明，先將樣品加入2%乙酸水浸泡后再用2%乙酸乙腈提取，測得樣品待測組分含量最高。分析原因，其一由于干茶葉粉末對待測組分有一定的吸附性，在用2%乙酸乙腈提取前先用乙酸水溶液浸泡，減小了茶葉的吸附性，從而提高了提取效率；其二，孔雀石綠及隱色孔雀石綠呈弱堿性，在水和乙腈中加入一定量的乙酸有利于孔雀石綠的溶出。因此，選擇先用2%乙酸水浸泡，再用2%乙酸乙腈提取。

2.2 加2%乙酸水溶液浸泡時間的優(yōu)化

試驗考查了加2%乙酸水浸泡0，0.5，1.0，2.0，4.0，8.0 h 及浸泡過夜7 種浸泡時間對待測組分測定結(jié)果的影響。

不同浸泡時間對待測組分含量的影響見圖2。

圖2 不同浸泡時間對待測組分含量的影響

結(jié)果表明，浸泡時間長短對孔雀石綠和隱色孔雀石綠的測定幾乎無影響，為節(jié)約試驗時間，同時又保證待測組分的溶出，加2%乙酸水溶液浸泡的時間選擇0.5 h。

2.3 提取溶劑的優(yōu)化

由于孔雀石綠與隱色孔雀石綠均為弱堿性，考慮在提取溶劑乙腈中加入適量有機酸使提取液呈弱酸性，更利于孔雀石綠和隱色孔雀石綠的溶出。通過試驗比較純乙腈溶液，0.1%甲酸乙腈，0.2%甲酸乙腈，0.5%甲酸乙腈，1%甲酸乙腈，、0.2%乙酸乙腈，0.5%乙酸乙腈，1%乙酸乙腈，2%乙酸乙腈9 種提取溶劑。

不同提取溶劑對待測組分含量的影響見圖3。

圖3 不同提取溶劑對待測組分含量的影響

試驗結(jié)果表明，甲酸乙腈溶液提取時，待測組分峰形較差，乙酸乙腈溶液提取時，待測組分峰形較好，且乙酸質(zhì)量分數(shù)為2% 時，測得陽性樣品中孔雀石綠和隱色孔雀石綠的含量都較高。因此，選擇2%乙酸乙腈溶液作為提取溶劑。

2.4 提取方式的優(yōu)化

試驗考查了均質(zhì)1 min、超聲30 min、渦旋提取1 min 和加入均質(zhì)子渦旋1 min 4 種提取方式。

不同提取方式對待測組分含量的影響見圖4。

圖4 不同提取方式對待測組分含量的影響

試驗結(jié)果表明，4 種提取方式對孔雀石綠和隱色孔雀石綠的測定幾乎無影響，為節(jié)約試驗時間且考慮操作簡單，選擇渦旋1 min 的提取方式。

2.5 渦旋時間的優(yōu)化

試驗考查了0，15，30，60，90，120 s 6 種渦旋時間的提取效果。

不同渦旋時間對待測組分含量的影響見圖5。

圖5 不同渦旋時間對待測組分含量的影響

試驗結(jié)果表明，渦旋時間達到30 s 以上時，孔雀石綠和隱色孔雀石綠的含量幾乎無明顯差異，為節(jié)約試驗時間，同時又保證待測組分的充分溶出，試驗選擇渦旋時間1 min。

2.6 流動相的選擇

考查了乙腈作為有機相，不同濃度的乙酸銨溶液（20，40，60，80，100 mmol/L） 作為水相時，對待側(cè)化合物峰形及靈敏度的影響。結(jié)果表明，當(dāng)乙腈作為有機相，20 mmol/L 乙酸銨溶液作為水相時，各待測化合物響應(yīng)好、靈敏度高、峰形好，隨著乙酸銨濃度的增加，孔雀石綠和隱色孔雀石綠的峰形變差，響應(yīng)變小， 故采用乙腈-20 mmol/L 乙酸銨溶液作為流動相。試驗考查了不同pH 值的乙酸銨溶液（pH 值3.5，pH 值4.5，pH 值5.5，pH 值7.5） 對待測化合物的影響，結(jié)果表明，水相具有一定酸性可有效改善各待測化合物的峰形，提高分離度，以及提高待測化合物的響應(yīng)。當(dāng)乙酸銨溶液的pH 值為4.5 時，各待測化合物的峰形好、靈敏度高、響應(yīng)好。因此，采用乙腈-20 mmol/L 乙酸銨溶液（pH 值4.5） 作為流動相。

2.7 采用空白基質(zhì)標準溶液定量的必要性

以苦丁茶為基質(zhì)，進行加標回收試驗。準確稱取2 g 粉碎后陰性樣品，添加孔雀石綠和隱色孔雀石綠標準品，制成孔雀石綠添加水平為15，30，150 μg/kg的樣品各6 份，隱色孔雀石綠添加水平為45，90，450 μg/kg 的樣品各6 份，按12.3 方法，分別采用裸標和空白基質(zhì)標準溶液2 種定量方式進行加樣回收試驗和精密度試驗；由表2 可知，孔雀石綠采用裸標定量方式的3 種添加水平的平均回收率均偏低，而隱色孔雀石綠采用裸標定量方式的3 種添加水平的平均回收率均偏高，不滿足食品補充檢驗方法編制技術(shù)的要求；由表3 可知，孔雀石綠采用空白基質(zhì)標準溶液定量方式，3 種添加水平的平均回收率為96.7%～111.4%，相對標準偏差為1.1%～4.6%，隱色孔雀石綠采用空白基質(zhì)標準溶液定量方式，3 種添加水平的平均回收率為99.7%～103.9%，相對標準偏差為2.2%～5.8%，均滿足GB/T 27404—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》規(guī)定。綜上所述，選取空白基質(zhì)標準溶液定量的方式。

孔雀石綠及隱色孔雀石綠采用裸標定量方式的加標回收率和相對標準偏差（RSD） （n=6） 見表2，孔雀石綠及隱色孔雀石綠采用空白基質(zhì)標準溶液定量方式的加標回收率和相對標準偏差（RSD）（n=6） 見表3。

表2 孔雀石綠及隱色孔雀石綠采用裸標定量方式的加標回收率和相對標準偏差（RSD） （n=6）

表3 孔雀石綠及隱色孔雀石綠采用空白基質(zhì)標準溶液定量方式的加標回收率和相對標準偏差（RSD） （n=6）

2.8 方法的線性范圍

取孔雀石綠質(zhì)量濃度為3，6，12，24，36，60 ng/mL 的系列基質(zhì)標準溶液和隱色孔雀石綠質(zhì)量濃度為9，18，36，72，108，180 ng/mL 的系列基質(zhì)標準溶液，在已優(yōu)化的色譜條件下，以峰面積比（Y） 對相應(yīng)的質(zhì)量濃度比（X） 作圖，繪制標準曲線（見圖6），并計算各待測物線性回歸方程及其相關(guān)系數(shù)。在相應(yīng)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，孔雀石綠和隱色孔雀石綠線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R均在0.990 以上，分別對苦丁茶中添加孔雀石綠5 μg/kg 和隱色孔雀石綠15 μg/kg 時，信噪比均大于10，因此最終確定該方法的定量限：孔雀石綠5 μg/kg 和隱色孔雀石綠15 μg/kg。

孔雀石綠和隱色孔雀石綠的基質(zhì)加標工作液液相色譜圖見圖6，孔雀石綠和隱色孔雀石綠在基質(zhì)中的保留時間和線性關(guān)系見表4。

圖6 孔雀石綠和隱色孔雀石綠的基質(zhì)加標工作液液相色譜圖

表4 孔雀石綠和隱色孔雀石綠在基質(zhì)中的保留時間和線性關(guān)系

2.9 實際樣品的測定

采用該方法對從市場購買的苦丁茶共計13 批次進行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2 份苦丁茶樣品中檢出孔雀石綠殘留。

實際樣品測定情況見表5。

表5 實際樣品測定情況

3 結(jié)論

采用高效液相色譜技術(shù)建立了苦丁茶中孔雀石綠及其代謝物的測定方法，方法對提取溶劑、提取方式及液相色譜條件進行了研究。方法回收率和相對標準偏差均能夠符合GB/T 27404—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》規(guī)定，可有效為食品安全監(jiān)管提供更有力的技術(shù)支撐。