曾紫怡，蔡鷹，劉佳華，廖思麗，張國(guó)光

(廣東海洋大學(xué)化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，廣東 湛江 524088)

0 引言

鱟血液是鱟試劑中唯一的核心原料，在醫(yī)療研究和臨床檢驗(yàn)中有著無(wú)可替代的作用和重要性，它能準(zhǔn)確和快速地檢測(cè)出被細(xì)菌感染的人體組織，且常被用于研究對(duì)癌癥的作用。殼聚糖具生物降解性、生物相容性、交聯(lián)粘附性、抗菌、消炎、止血和生物活性等優(yōu)勢(shì)[1]，白蛋白可以靶向于腫瘤細(xì)胞，而微球粒徑微小，能較容易地通過(guò)EPR 效應(yīng)富集于腫瘤部位，從而實(shí)現(xiàn)抗腫瘤藥物的被動(dòng)靶向治療。通過(guò)制備殼聚糖修飾的載鱟血蛋白-白蛋白微球，對(duì)白蛋白活性氨基進(jìn)行適當(dāng)?shù)男揎?，將?nèi)源性白蛋白用于構(gòu)建微球載藥傳遞系統(tǒng)，提高鱟血蛋白藥物的穩(wěn)定性和靶向性，使其發(fā)揮緩釋、控釋作用，為探究其抗腫瘤活性和其他生物活性提供依據(jù)。

1 儀器與藥品

1.1 儀器

臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、臺(tái)式冷凍干燥機(jī)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、掃描電鏡、納米粒度及ZETA 電位分析儀、傅里葉變換紅外光譜儀科技有限公司、超凡型小容量恒溫培養(yǎng)儀、數(shù)顯恒流泵、pH 計(jì)、超聲波清洗機(jī)、恒溫加熱磁力攪拌器。

1.2 藥品

牛血清白蛋白；鱟血漿粗粉、殼聚糖(甲殼胺)；考馬斯亮藍(lán)G250；胰蛋白酶(牛胰)、胃蛋白酶；25% 戊二醛溶液、三聚磷酸鈉、其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 鱟血脫銅蛋白的制備

取一定量鱟血粉末，于NaCl 溶液、磷酸緩沖液和適量純化水中充分溶解，后放入65 ℃水浴鍋中水浴攪拌25 min，取出放入冰水中冷卻至10 ℃，隨后將溶液置于離心機(jī)中離心(3 500 r/min，30 min，4 ℃)。將離心后的上清液倒入干凈的燒杯中，向上清液中加入25.0 mL一定濃度的乙二胺四乙酸二鈉水溶液，再放入35 ℃水浴鍋中水浴攪拌25 min，后加入25.0 mL 的丙酮溶液，繼續(xù)放入35 ℃水浴鍋中水浴攪拌20 min，后將溶液放入離心機(jī)離心得到沉淀(3 500 r/min，30 min，4 ℃)。將所得沉淀置于干凈的燒杯中，加入10 mL 的純化水，再次加入20.0 mL 的乙二胺四乙酸二鈉溶液在30 ℃的條件下水浴攪拌反應(yīng)20 min，后加入20.0 mL丙酮于燒杯中繼續(xù)在30 ℃的條件下水浴攪拌10 min，反應(yīng)完成后溶液倒入離心管中離心(3 500 r/min，30 min，4 ℃)。得鱟血脫銅蛋白沉淀，用蒸餾水洗滌沉淀三次后放入冷凍干燥機(jī)冷凍干燥得鱟血脫銅蛋白粉末。

2.2 鱟血水解蛋白制備

根據(jù)文獻(xiàn)[2]，取一定量鱟血脫銅蛋白粉末加入胰蛋白酶，調(diào)節(jié)其溶液的pH 值使其為8.00，50 ℃的條件下恒溫水浴攪拌水解3 h 后得鱟血水解蛋白溶液。待其沉淀后取上清液，冷凍干燥后即得鱟血水解蛋白粉末。

2.3 殼聚糖-白蛋白復(fù)合微球的制備

分別配制1.0 mg/mL 的殼聚糖和三聚磷酸鈉溶液，用NaOH 和鹽酸調(diào)節(jié)二者pH 使其=5.00。其次向40.0 mL 的殼聚糖溶液中緩慢的滴加將10.0 mL 的三聚磷酸鈉溶液，充分?jǐn)嚢? h 后形成殼聚糖-三聚磷酸鈉混懸液。隨后混懸液中加入200 mg 牛血清白蛋白，放入恒溫水浴鍋中在90 ℃條件下攪拌充分反應(yīng)1 h，待溶液冷卻后使用NaOH 調(diào)節(jié)溶液的pH 至5.95，再在常溫下使用磁力攪拌0.5 h，即得殼聚糖-白蛋白復(fù)合微球混懸液。最后將混懸液倒入離心管中放入離心機(jī)中離心(3 500 r/min，30 min，4 ℃)，經(jīng)冷凍干燥24 h 后即得殼聚糖-白蛋白復(fù)合微球凍干粉。

2.4 鱟血水解蛋白-殼聚糖-白蛋白微球的制備

取一定量鱟血水解蛋白和100 mg 殼聚糖-白蛋白微球，加入4.0 mL 磷酸鹽緩沖液并攪拌，隨后緩慢滴加24.0 mL 無(wú)水乙醇，在溶液變白時(shí)加入35.0 μL戊二醛，持續(xù)攪拌13 h 后得到鱟血水解蛋白-殼聚糖-白蛋白微球混懸液。冷凍干燥后即得鱟血水解蛋白-殼聚糖-白蛋白微球凍干粉[3]。

2.5 單因素設(shè)計(jì)

(1)鱟血水解蛋白用量。設(shè)計(jì)各組加入鱟血水解蛋白用量分別為30、40、50、60、70 mg，4.0 mL 的磷酸鹽緩沖液(pH=8.0)、攪拌轉(zhuǎn)速為1 200 r/min、攪拌時(shí)間為12 h、100 mg 殼聚糖-牛血清白蛋白微球、無(wú)水乙醇用量為24.0 mL、25%戊二醛用量為35μL。結(jié)果各組的包封率分別為86.39%、74.31%、48.21%、39.64%、23.69%。

(2) 磷酸鹽緩沖液pH。設(shè)計(jì)各組加入4.0 mL 磷酸鹽緩沖液的pH 值分別為6.0、7.0、8.0、9.0，攪拌轉(zhuǎn)速為1 200 r/min、攪拌時(shí)間為12 h、50 mg 鱟血水解蛋白、100 mg 殼聚糖-牛血清白蛋白微球、無(wú)水乙醇用量為24 mL、25%戊二醛用量為35.0 μL。結(jié)果各組的包封率為68.89%、76.68%、84.49%、63.15%。

(3)攪拌時(shí)間。設(shè)計(jì)各組攪拌時(shí)間分別為8、10、12、14、16 h，4.0 mL 的磷酸鹽緩沖液(pH=8.0)、攪拌轉(zhuǎn)速為1 200 r/min、100 mg 殼聚糖-牛血清白蛋白微球、30 mg 鱟血水解蛋白、無(wú)水乙醇用量為24.0 mL、25%戊二醛用量為35.0 μL。結(jié)果各組的包封率分別為66.12%、84.42%、87.82%、79.90%、53.20%。

(4)交聯(lián)劑濃度。設(shè)計(jì)各組加入戊二醛濃度分別為10%、20%、30%、40%、50%，4.0mL 磷酸鹽緩沖液(pH=8.0)、攪拌轉(zhuǎn)速為1 200 r/min、攪拌時(shí)間為12 h、100 mg 殼聚糖-牛血清白蛋白微球、50 mg 鱟血水解蛋白、無(wú)水乙醇用量為24.0 mL。結(jié)果各組的包封率為39.76%、65.25%、75.37%、53.64%、40.62%、12.70%。

2.6 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

由單因素設(shè)計(jì)結(jié)果，以載藥微球的包封率為指標(biāo)，通過(guò)探究鱟血水解蛋白用量(25 mg、30 mg、35 mg)、磷酸鹽緩沖液pH 值(pH=7.5、8.0、8.5)、攪拌時(shí)間(11 h、12 h、13 h)、戊二醛濃度(20%、25%、30%) 確定最佳工藝條件。每個(gè)因素采用三個(gè)水平，按照L9(34)正交設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果為1(25 mg、pH=7.5、11 h、20%)包封率為87.49%；2(25 mg、pH=8.0、13 h、25%)包封率為80.86%；3(25 mg、pH=8.5、12 h、30%)包封率為87.36%；4(30 mg、pH=7.5、13 h、30%)包封率為67.08%；5(30 mg、pH=8.0、12 h、20%)包封率為83.20%；6(30 mg、pH=8.5、11 h、25%)包封率為85.59%；7(35 mg、pH=7.5、12 h、25%)包封率為81.58%；8(35 mg、pH=8.0、11 h、30%)包封率為72.74%；9(35 mg、pH=8.5、13 h、20%)包封率為85.78%

可知，當(dāng)鱟血水解蛋白用量為25 mg、磷酸鹽緩沖液pH 值為8.5、攪拌時(shí)間為13 h 及戊二醛濃度為20%時(shí)為制備載藥微球最佳條件。

2.7 載藥微球的表征

2.7.1 粒徑與表面形態(tài)

將冷凍干燥所得鱟血水解蛋白-殼聚糖-白蛋白微球粉末置于燒杯中，超聲2 h 后冷凍干燥得樣品粉末，經(jīng)掃描電鏡觀察載藥微球的粒徑以及表面形貌，結(jié)果如圖1 所示。

圖1 載藥微球掃描電鏡圖

由圖1 可知，鱟血水解蛋白-殼聚糖-白蛋白微球呈球形或類球形，粒徑大小較為均一，粒徑范圍為(285±54) nm。

2.7.2 Zeta 電位的測(cè)定

取鱟血水解蛋白-殼聚糖-牛血清白蛋白微球適量，按要求稀釋后置于Zeta 電位及粒度分析儀中測(cè)定。Zeta電位測(cè)定結(jié)果為(-42.69±3.69)mV，體系較為穩(wěn)定。

2.7.3 水合粒徑的測(cè)定

將樣品分散均勻，略微渾濁但能透光為最佳，置于納米粒度及ZETA 電位分析儀中測(cè)試。如圖2 所示，測(cè)試結(jié)果為664.7 nm，分布系數(shù)為0.558 9。

圖2 水合粒徑測(cè)試結(jié)果

2.7.4 包封率和載藥量的測(cè)定

(1)樣品預(yù)處理。將鱟血水解蛋白-殼聚糖-白蛋白微球混懸液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，蒸出樣品溶液中殘留的乙醇，以3 500 r/min 高速離心后取上清液，鱟血水解蛋白-殼聚糖-白蛋白微球固體保存。上清液定容于25 mL 容量瓶，固體進(jìn)行真空冷凍干燥。

(2)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。取50 mg 鱟血水解蛋白，置于25.0 mL 容量瓶用純化水進(jìn)行定容，配制成2 mg/mL鱟血水解蛋白溶液。分別取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 水解蛋白溶液加純化水定容到1.0 mL，再向其加入5 mL考馬斯亮藍(lán)溶液，置于紫外分光光度計(jì)中進(jìn)行測(cè)量，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)為595 nm。得鱟血水解蛋白溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線：

(3)測(cè)定包封率和載藥量。取1.0 mL 上清液加入于5.0 mL 考馬斯亮藍(lán)溶液中，充分反應(yīng)后置于紫外分光光度計(jì)中進(jìn)行測(cè)量，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)為595 nm 測(cè)得上清液中游離鱟血水解蛋白的重量。將鱟血水解蛋白-殼聚糖-白蛋白微球粉末置于電子分析天平稱量，得載藥微球的重量。

計(jì)算公式：

式中：W總為鱟血水解蛋白總量；W游為上清液中游離的鱟血水解蛋白重量；W載藥微球?yàn)轺c血水解蛋白-殼聚糖-白蛋白微球粉末總重量。

結(jié)果：包封率為(83.075±4.86)%，載藥量為(34.25±2.41)%。

2.7.5 體外釋放實(shí)驗(yàn)

分別準(zhǔn)確稱取60 mg 的載藥微球和鱟血水解蛋白，置于含有3.0 mL 的人工血液、腸液、胃液[4](pH 7.4、pH=6.8、pH=1.2) 透析袋內(nèi)(截留量70 kDa)，使透析袋內(nèi)藥物濃度達(dá)到20 mg/mL。再將透析袋置于裝有30.0 mL 磷酸鹽緩沖液的培養(yǎng)皿中，使得透析袋全部浸入緩沖液中，放入恒溫振蕩儀中在37 ℃、100 r/min下恒溫振蕩，分別在振蕩1、2、4、6、8、12、24 h 各取出培養(yǎng)皿中1.0 mL 的磷酸鹽緩沖液，同時(shí)加入等量介質(zhì)。取出的1.0 mL 的釋放介質(zhì)于595 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度。計(jì)算水解蛋白的累積釋放率，得體外釋放曲線。結(jié)果如圖3、圖4、圖5 所示。

圖3 人工血液體外釋放曲線

圖4 人工腸液體外釋放曲線

圖5 人工胃液體外釋放曲線

計(jì)算公式：

根據(jù)體外釋放曲線得知，載藥微球初始時(shí)有突釋的現(xiàn)象出現(xiàn)，隨后的釋放量逐漸平緩，前8 h 載藥微球與鱟血水解蛋白的釋放效率都較快，到12 h 時(shí)釋放基本完成，在人工血液、腸液、胃液中，載藥微球的累積釋放量分別為52.48%、53.68%、45.21%。24 h 時(shí)的各組鱟血水解蛋白的累積釋放量均高于86.00%，而載藥微球的累積釋放量分別為55.63%、55.25%、48.75%，說(shuō)明載藥微球具有較好的緩釋效果。

3 結(jié)語(yǔ)

本研究制備微球的最優(yōu)處方為鱟血水解蛋白用量為25 mg、磷酸鹽緩沖液pH 值為8.5、攪拌時(shí)間為13 h 及戊二醛濃度為20%、Zeta 電位值為(-42.69±3.69)mV、粒徑為(285±54)nm、包封率為(83.075±4.86)%、載藥量為(34.25±2.41)%。制得的鱟血水解蛋白-殼聚糖-白蛋白微球生物相容性高，有較好的穩(wěn)定性，藥物釋放具有明顯的緩釋效果。