王 萍，劉 艷，杭 婧，李 佳，王玉

淮安市食品藥品檢驗所，淮安223300

猴耳環(huán)消炎顆粒是由單味藥材猴耳環(huán)制成的中藥制劑。猴耳環(huán)主要含有黃酮類、酚酸類等有效成分，如沒食子酸、槲皮苷、楊梅苷等[1，2]。其中，沒食子酸具有抗菌、抗病毒等作用；槲皮苷具有祛痰、止咳、消炎鎮(zhèn)痛等作用[3，4]；楊梅苷具有很強的抗氧化性和消炎、抗菌、鎮(zhèn)痛、降血糖、保肝、抗腫瘤等功效[5]?！吨袊幍洹?020 年版規(guī)定，采用雙波長、混合對照的方法對猴耳環(huán)消炎片[6]和猴耳環(huán)消炎膠囊[7]中的沒食子酸和槲皮苷兩種成分進行質(zhì)量控制?！秶宜幤窐?biāo)準(zhǔn)》新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)第86冊[8]中，猴耳環(huán)消炎顆粒含量測定項下僅有沒食子酸的含量控制指標(biāo)?，F(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)均以沒食子酸和槲皮苷雙對照品法對猴耳環(huán)消炎片[9]及猴耳環(huán)消炎膠囊[10]進行質(zhì)量控制，而對猴耳環(huán)消炎顆粒的質(zhì)量控制尚不完善。鑒于中藥成分對照品成本高、檢驗步驟復(fù)雜，本研究選擇價廉易得的沒食子酸作為內(nèi)參，建立其與槲皮苷和楊梅苷的相對校正因子（relative correction factor，RCF），采用高效液相色譜一測多評法（HPLC-quantitative analysis of multi-components by single marker，HPLC-QAMS），實現(xiàn)對猴耳環(huán)消炎顆粒的多指標(biāo)質(zhì)量評價。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 2695/2998 高效液相色譜儀、Waters X bridge C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、SunFire C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）[沃特世科技（上海）有限公司]；UltiMate 3000 高效液相色譜儀（賽默飛世爾科技公司）；Agilent 1260 高效液相色譜儀、Agilent Eclipse Plus C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）（安捷倫科技有限公司）；XS-205DU 電子天平、XP-6 電子天平（梅特勒托利多集團）；Milli-Q 型超純水機（德國默克公司）。

1.2 試劑及藥品

沒食子酸對照品（批號110831-201906，純度91.5%）、楊梅苷對照品（批號111860-201703，純度95.2%）、槲皮苷對照品（批號111538-202007，純度93.5%）均購自中國食品藥品檢定研究院；猴耳環(huán)消炎顆粒購自江西杏林白馬藥業(yè)公司（批號200108、191260、191192、191169）和廣州泰萊制藥有限公司（批號2005061、1912321、1912121、2005081、2108021）。

甲醇、乙腈（色譜純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司），磷酸（色譜純，阿拉丁試劑有限公司），水為自制超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

混合對照品溶液：取沒食子酸、楊梅苷和槲皮苷對照品各適量，分別精密稱定，加入50%甲醇溶解并定量稀釋制成含沒食子酸、楊梅苷和槲皮苷濃度分別為150、2.5、4.0 μg·mL-1的混合對照品儲備液。

供試品溶液：取猴耳環(huán)消炎顆粒約1.1 g，精密稱定，置50 mL 具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱定重量，超聲提?。?50 W，100 kHz）20 min，放冷后補足失重，0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.2 色譜條件

Agilent Eclipse Plus C18色譜柱（4.6 mm ×250 mm，5 μm）；流動相A 為乙腈，流動相B 為0.2%磷酸溶液[11，12]，線性梯度洗脫（A:B）：0 min（3:97）→10 min（3:97）→25 min（20:80）→35 min（20:80）→40 min（25:75）→50 min（50:50）→55 min（3:97）→60 min（3:97）；流速0.8 mL·min-1；柱溫25℃；檢測波長325 nm；進樣體積20 μL。典型色譜圖見圖1。

圖1 猴耳環(huán)消炎顆粒HPLC 典型色譜圖

2.3 方法學(xué)驗證

2.3.1 線性關(guān)系考察 按“2.2”項下色譜條件，精密吸取“2.1”項下混合對照品儲備液2、4、8、16、32 μL，進樣并記錄色譜圖，測定各對照品的峰面積。以各成分色譜峰面積（Y）對進樣溶液中的系列質(zhì)量（X，μg）進行線性回歸分析。結(jié)果表明，沒食子酸、楊梅苷和槲皮苷在各自的系列進樣質(zhì)量范圍內(nèi)，與峰面積響應(yīng)均呈良好線性關(guān)系，見表1。

表1 3 種成分的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍

2.3.2 校正因子f 的建立及耐用性評價 精密吸取混合對照品溶液5、10、15、20、30 μL，按“2.2”項下色譜條件測定，每個濃度分別進樣3 次，取平均值，記錄各對照品的色譜峰面積，根據(jù)校正因子計算公式：

式中，CA為待測物的濃度；AA為待測物的峰面積；CB為沒食子酸的濃度；AB為沒食子酸的峰面積。

計算待評價成分楊梅苷、槲皮苷的校正因子fA/B，見表2。

表2 楊梅苷、槲皮苷的校正因子fA/B

2.3.2.1 不同色譜柱對fA/B的影響 取“2.1”項下的混合對照品溶液，分別精密吸取20 μL，以0.8 mL·min-1的流速在Waters 2695/2998 高效液相色譜儀上運行，考察3 種色譜柱對各成分fA/B的影響，均能達到較好的分離效果，楊梅苷、槲皮苷的fA/B的RSD值依次為0.42%、0.48%，表明色譜柱的更換對各成分fA/B無顯著影響。

2.3.2.2 不同流速對fA/B的影響 取“2.1”項下的混合對照品溶液，分別精密吸取20 μL，采用Agilent Eclipse Plus C18色譜柱，考察3 種流速在Waters 2695/2998 高效液相色譜儀上的運行，各成分均能達到較好的分離效果，楊梅苷、槲皮苷的fA/B的RSD值依次為0.37%、0.51%。表明流速對各成分fA/B無顯著影響。

2.3.2.3 不同儀器對fA/B的影響 取“2.1”項下的混合對照品溶液，分別精密吸取20 μL，采用Agilent Eclipse Plus C18色譜柱，以0.8mL·min-1的流速分別在3 種高效液相色譜儀上檢測，各成分均能達到較好的分離效果，楊梅苷、槲皮苷的fA/B的RSD 值依次為0.52%、0.34%，表明不同儀器對各成分fA/B無顯著影響。

2.3.2.4 色譜峰定位參數(shù)考察 取混合對照品溶液，分別采用3 種色譜柱，在3 種色譜儀上測定并計算待測成分沒食子酸、楊梅苷和槲皮苷的相對保留時間值（R），結(jié)果見表3。

表3 儀器與色譜柱對猴耳環(huán)消炎顆粒中3 個成分相對保留時間的影響

2.3.3 進樣精密度試驗 精密吸取“2.1”項下混合對照品儲備液20 μL，按“2.2”項下條件，連續(xù)進樣6次。結(jié)果顯示，測得沒食子酸、楊梅苷、槲皮苷峰面積的RSD（n=6）分別為0.20%、0.18%、0.31%。

2.3.4 重復(fù)性試驗 取批號為200108 的猴耳環(huán)消炎顆粒適量，按“2.1”項下方法平行制備供試品溶液6 份，按“2.2”項下條件進行測定。記錄3 個化合物峰面積積分值并計算RSD，結(jié)果顯示沒食子酸、楊梅苷、槲皮苷含量的RSD（n=6）分別為0.41%、0.36%、0.26%。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗 取批號為200108 的猴耳環(huán)消炎顆粒，按“2.1”項下方法制備供試品溶液，室溫放置0、8、12、16、20、24 h 后，按“2.2”項下條件進樣測定。結(jié)果顯示沒食子酸、楊梅苷、槲皮苷峰面積的RSD（n=6）分別為0.36%、0.27%、0.34%，說明供試品溶液中這3 個成分在室溫放置24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗 分別精密稱取沒食子酸、楊梅苷和槲皮苷對照品適量，置50 mL 量瓶中，加50%甲醇溶液定容至刻度，配制成混合對照品溶液（沒食子酸3.203 6 mg·mL-1、楊梅苷0.054 7 mg·mL-1、槲皮苷0.103 7 mg·mL-1）。

平行稱定9 份樣品（批號200108）1.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分成3 組，每組3 份，每組精密加入混合對照溶液1.0、2.0 和3.0 mL（相當(dāng)于供試品中待測成分含量的50%、100%、150%），每個濃度平行3 份。按“2.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項下條件進樣測定，根據(jù)公式計算沒食子酸、楊梅苷、槲皮苷的加樣回收率，結(jié)果見表4。

表4 加樣回收率實驗結(jié)果（n=3）

2.4 HPLC-QAMS 法與ESM 法結(jié)果比較

取9 批猴耳環(huán)消炎顆粒樣品溶液適量，進樣測定，采用HPLC-QAMS 法與ESM 法分別計算樣品中沒食子酸、楊梅苷和槲皮苷的含量，結(jié)果見表5。2種方法的含量測定結(jié)果無明顯差異，說明HPLCQAMS 法可用于猴耳環(huán)消炎顆粒中3 個成分的含量測定。

表5 9 批猴耳環(huán)消炎顆粒中3 種成分的含量測定結(jié)果（mg/袋）

3 討論

3.1 測定波長的選擇

本研究通過對比不同波長（270、325、350 nm）下的HPLC 色譜圖發(fā)現(xiàn)，沒食子酸在270 nm 下峰高明顯高于另外3 個成分，但在350 nm 下幾乎沒有吸收，而在325 nm 下檢測到各色譜峰分離度及峰形良好，基線平穩(wěn)，在此波長下通過HPLC-QAMS 法計算出的結(jié)果準(zhǔn)確性高，線性關(guān)系良好，故最終選擇325 nm 作為檢測波長。

3.2 參比物質(zhì)和質(zhì)量控制的選擇

猴耳環(huán)消炎顆粒具有清熱解毒、涼血消腫、止瀉的功效，可用于治療急性咽喉炎、急性扁桃體炎、急性胃腸炎等。其中，作為主要成分的沒食子酸，價廉易得，且具有良好的穩(wěn)定性，而楊梅苷和槲皮苷價格高昂，不易獲取，穩(wěn)定性也不及沒食子酸。選擇沒食子酸作為參比物質(zhì)，各成分的RCF 穩(wěn)定，重現(xiàn)性良好，既節(jié)約了成本，又提高了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3.3 HPLC-QAMS 法用于猴耳環(huán)消炎顆粒質(zhì)量控制的合理性與意義

本實驗以沒食子酸為內(nèi)參物，按照相對保留時間確定槲皮苷和楊梅苷2 個成分色譜峰，建立其RCF，并最終確定了3 個活性成分的含量，完善了猴耳環(huán)消炎顆粒的多指標(biāo)質(zhì)量評價，有利于保證該產(chǎn)品的質(zhì)量可控和療效穩(wěn)定，同時節(jié)約檢測時間和成本，對該產(chǎn)品的質(zhì)量控制具有重要意義，也為其他中成藥及中藥飲片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升提供借鑒和參考。