趙軍, 毛亮, 沈繼杰, 孫宏斌

鐵死亡是一種鐵依賴性細胞死亡模式,特征改變是脂質過氧化導致活性氧(reactive oxygen species,ROS)大量累積及谷胱甘肽過氧化物酶4(GPX4)的失活,機制特征不同于細胞凋亡等其他細胞死亡方式。GPX4是鐵死亡關鍵調控蛋白[1], 在前列腺癌中呈高表達[2]。下調其表達可引發(fā)腫瘤細胞鐵死亡,是腫瘤治療中區(qū)別于傳統療法的新策略,已引起臨床極大關注。多個研究發(fā)現microRNA-15a、microRNA-214-3p等小分子mRNA抑制物參與調控前列腺癌鐵死亡[3-4]。癌相關成纖維細胞(CAFs)是腫瘤微環(huán)境中基質細胞的主要成分,可通過傳遞外泌體miR-522抑制鐵死亡促進胃癌化療耐藥[5]。在前列腺癌中,CAFs與GPX4高表達及與鐵死亡的關聯性還未可知。課題組前期已經報道CAFs在體外和體內實驗條件下可顯著促進前列腺癌細胞增值和侵襲[6],本研究擬觀察CAFs來源的外泌體(CAFs-exo)是否通過調控前列腺癌鐵死亡促發(fā)前列腺癌細胞增殖和遷移。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 細胞 人前列腺癌細胞株22rv1和PC-3 購自中國科學院細胞庫。前列腺癌新鮮組織取自南京市第一醫(yī)院泌尿外科行前列腺癌根治術患者,由病理科醫(yī)生確診取材,獲得富含腫瘤區(qū)域的癌組織及癌旁組織,本研究經倫理委員會批準,獲患者知情同意。

1.1.2 主要試劑及儀器 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶購均自美國Gibco公司;無外泌體血清購自美國System Bioscience公司;腫瘤組織解離液購自德國Miltenyi公司;Transwell小室、Mgtrigel 基質膠購自美國Corning公司;α-SMA、FSP-1、Vimentin、E-cadherin、N-cadherin、β-catenin、Actin、NFR2、ACSL4、GPX4、GAPDH一抗購自中國Proteintech公司,FAP一抗購自美國Cell Signaling Technology公司,IgG二抗購自中國Biosharp公司;鐵死亡誘導劑Erastin購自美國Medcheemexpress公司;ROS檢測試劑盒、細胞死亡PI檢測試劑盒購自中國KeyGEN 公司;線粒體膜電位(mitochondrial membrane potentia,MMP)檢測試劑盒購自中國 Beyotime公司;DxFLEX流式細胞儀、超速離心機、酶標儀購自德國,BECKMAN公司;熒光顯微鏡購自德國Zeiss公司;Western blot電泳儀購自中國Tanon公司。

1.2 細胞培養(yǎng)和鑒定

1.2.1 CAFs和NFs培養(yǎng) 按課題組已建立的方法[6],收集前列腺癌癌組織和癌旁新鮮組織,無菌PBS液沖洗2次,于超凈臺中將組織樣本剪碎至2 mm大小,組織解離液消化30 min,1 000rpm離心5 min,棄上清,加入含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中重新懸浮,并傳遞到培養(yǎng)皿中,洗去組織碎片和沒有貼壁的細胞,每3～4 d更換培養(yǎng)液傳代1次,取第二代到第六代細胞進行實驗研究。

1.2.2 CAFs和NFs表型鑒定 免疫熒光和Western blot檢測NFs和CAFs中α-SMA、FAP和FSP-1蛋白表達水平。免疫熒光實驗步驟為:將細胞接種到24孔板,貼壁后4%多聚甲醛固定15 min,1% TritonX-100冰上通透15 min,加入5%的BSA溶液(含有0.2% TritonX-100)37 ℃封閉1 h,加入1∶200的α-SMA、FSP-1、FAP一抗,4 ℃孵育過夜,然后用TBST洗3次,然后加入稀釋好的熒光二抗,37 ℃孵育1.5 h,TBST洗3次后,取出細胞爬片置于載玻片上用DAPI染細胞核,在熒光顯微鏡下觀察熒光強度。

1.2.3 前列腺癌細胞培養(yǎng) 取液氮中保存的前列腺癌細胞22rv1和PC-3,于37 ℃水浴鍋中迅速解凍,加入完全培養(yǎng)基中和凍存液,1 000 rpm離心5 min,棄去上清,加入含有10%血清的1640完全培養(yǎng)基,吹打混勻后,加入培養(yǎng)瓶中,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 外泌體提取和鑒定

1.3.1 外泌體提取 超速離心法提取外泌體。使用無外泌體血清培養(yǎng)CAFs和NFs,收集上清液,在10 000 g下離心30 min去除碎片,然后在超速離心機110 000 g下離心120 min,棄去上清液,從沉淀物中收集外泌體并重新懸浮在PBS中,置-80 ℃冰箱保存。所有步驟均在4 ℃環(huán)境下進行。

1.3.2 外泌體鑒定 ①Western blot檢測TSG101、CD63、CD9蛋白表達;②透射電鏡:將外泌體置7.2%戊二醛液4 ℃固定過夜,PBS液沖洗后置1%四氧化鋨室溫固定60 min,包埋于10%明膠,戊二醛固定后切成<1 mm3小塊。按酒精梯隊脫水(酒精濃度分別為30%,50%,70%,90%,95%和100%),環(huán)氧丙烷交換純醇,Quetol-812環(huán)氧樹脂(濃度分別為25%,50%,75%和100%)與環(huán)氧丙烷混合浸潤標本,包埋并聚合(35 ℃ 12 h,45 ℃ 12 h,60 ℃ 24 h)。徠卡UC100切片機切割超薄切片(6 nm),經乙酸鈾酰和檸檬酸鉛染色后在FEI Tecnai T20透射電鏡中觀察外泌體形態(tài);③納米顆粒跟蹤技術(nanoparticle tracking analysis,NTA):將外泌體以5 mg/L的濃度重懸于PBS中,進一步將懸液稀釋100～500倍。在環(huán)境溫度下手動將樣品注入樣品室。每個樣品都配置有488 nm激光器和高靈敏度sCMOS相機,通過收集納米顆粒散射光信號,拍攝一段納米顆粒在溶液中做布朗運動的影像,對每個顆粒的布朗運動進行追蹤。最后,使用NTA分析軟件計算出外泌體的半徑和濃度。

1.4 細胞遷移和侵襲實驗

用不含血清的1640培養(yǎng)基稀釋22rv1和PC-3細胞,接種至Transwell小室,加入100 μL基質膠和培養(yǎng)基的混合物(比例1∶7),置37 ℃恒溫培養(yǎng)并凝固2 h,每個小室加入1×105個細胞懸液200 μL,每組分別加入PBS、CAFs-exo和NFs-exo,外泌體終濃度為10 mg/L,將小室放入24孔板中,每孔加入600 μl含有1 μmol/L Erastin 的1640完全培養(yǎng)基,置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱24 h。PBS清洗,4%多聚甲醛固定Transwell小室15 min,結晶紫染色15 min,PBS液清洗,倒置顯微鏡下觀察拍照,image J軟件分析比較各組細胞遷移以及侵襲的細胞數并統計分析。

1.5 細胞劃痕實驗

在6孔板中接種22rv1和PC-3細胞,待細胞生長匯合至90%,用10 μL槍頭配合直尺在每孔單層細胞上豎痕,使細胞形成傷口模型,PBS清洗兩遍去除劃痕處細胞,在顯微鏡下觀察并拍照記作0 h,加入含有1 μmol/L Erastin的1640培養(yǎng)基,每組分別加入PBS、CAFs-exo、NFs-exo,外泌體濃度為10 mg/L,24 h后在顯微鏡下觀察細胞劃痕的愈合程度并拍照。

1.6 平板克隆實驗

將約500個22rv1和PC-3細胞接種到6孔板中,37 ℃恒溫培養(yǎng)2周。去除培養(yǎng)液,PBS清洗,加入4%多聚甲醛固定細胞,加入結晶紫染色,觀察細胞菌落數量并拍照。

1.7 ROS水平、細胞死亡、線粒體膜電位檢測:評估細胞鐵死亡相關指標

1.7.1 ROS水平檢測 按ROS檢測試劑盒步驟進行。所檢測的細胞數<5×105/ml,去除培養(yǎng)液,加入含有10 μmol/L DCFH-DA的無血清培養(yǎng)液,在37 ℃避光的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min。使用激發(fā)波長488 nm和發(fā)射波長525 nm測量熒光,每組的平均熒光強度表示細胞內ROS的量。

1.7.2 細胞死亡檢測 將細胞均勻地生長在12孔板中,10 μmol/L Erastin處理后收集細胞,重新懸浮在流管中(50 000個細胞/管),與2 μL的PI試劑孵化10 min,流式細胞儀分析死亡細胞情況。

1.7.3 線粒體膜電位(MMP)檢測 將細胞均勻地生長在6孔板中,按照試劑商說明用適量的TMRE工作液孵育15 min,用PBS去除殘留的TMRE,收集標記的細胞,通過熒光信號的強弱來檢測MMP的變化,MMP降低熒光強度減弱。使用酶標儀檢測細胞熒光強度,其激發(fā)波長為550 nm,發(fā)射波長為575 nm。

1.8 Western blot實驗 胰蛋白酶消化細胞后離心,RIPA裂解液提取細胞總蛋白,BCA法測量蛋白濃度。加入SDS上樣緩沖液,100 ℃水浴中煮沸15 min,蛋白充分變性后將樣品上樣到SDS-PAGE凝膠中電泳,轉PVDF膜上,5%脫脂牛奶封閉膜2 h,加入1∶2 000一抗稀釋液4 ℃孵育過夜,TBST洗膜3次后,加入1∶5 000稀釋的二抗在搖床上室溫孵育2 h,TBST洗膜3次,每次15 min,配置化學發(fā)光液,曝光機下曝光。

1.9 統計學分析

2 結果

2.1 CAFs原代培養(yǎng)及表型鑒定

CAFs和NFs均陽性表達特征蛋白α-SMA、FAP和FSP-1,但CAFs熒光染色強度(圖1)及蛋白表達量(圖2)均高于NFs。

圖1 免疫熒光鑒定NFs和CAFs的結果 細胞呈長梭形或不規(guī)則三角形,放射狀生長,細胞鋪滿瓶底后相互交織,細胞間幾乎沒有間隙,CAFs和NFs均陽性表達特征蛋白α-SMA、FAP和FSP-1,CAFs中α-SMA、FAP以及FSP1的熒光強度高于NFs,比例尺為50 μm

圖2 Western blot鑒定NFs和CAFs表面標記物α-SMA、FAP、FSP-1表達 CAFs中α-SMA、FAP以及FSP-1的蛋白表達量均高于NFs

2.2 外泌體鑒定

CAFs-exo和NFs-exo均呈典型的球形膜狀結構(圖3),粒徑大多為30～150 nm(圖4),Western blot檢測示特征性蛋白CD9、CD63、TSG101均表達陽性(圖5)。

圖3 透射電子顯微鏡下外泌體的形態(tài) NFs(3A)和CAFs(3B)的外泌體形態(tài)都呈球形膜狀結構,比例尺為100 nm

圖4 納米顆粒跟蹤分析外泌體的直徑

圖5 Western blot檢測NFs和CAFs外泌體的表面標志蛋白 NFs和CAFs的外泌體均表達TSG101、CD63和CD9標志蛋白

2.3 CAFs-exo抑制Erastin誘導的鐵死亡

用鐵死亡誘導劑Erastin分別處理前列腺癌細胞22rv1和PC-3,相比于未處理的對照組癌細胞,均呈現鐵死亡特征改變,ROS水平升高(P<0.001)、細胞死亡數目增加(P<0.001),線粒體膜電位下降(P<0.001)(圖6)。分別予CAFs-exo和NFs-exo共培養(yǎng)處理細胞, NFs-exo組相較于 Erastin組,ROS水平、細胞死亡率以及線粒體膜電位,差異均無統計學意義(P>0.05);而CAFs-exo組相較于 Erastin組和NFs-exo組,ROS水平下降(P<0.001),細胞死亡率下降(P<0.001),膜電位水平升高(P<0.01)(圖6)。

注: **為P<0.01;***P<0.001,#為P>0.05

Western blot顯示, NFs-exo組相較于Erastin組,NRF2、ACSL4和GPX4蛋白表達水平差異無統計學意義(P>0.05);而CAFs-exo組相較于 Erastin組和NFs-exo組,NRF2表達水平降低(P<0.05),ACSL4表達水平降低(P<0.01),GPX4表達水平升高(P<0.01)(圖7)。

注:*為 P<0.05,**為 P<0.01,#為P>0.05

2.4 CAFs-exo抑制鐵死亡促進細胞增殖和遷移

Transwell實驗示,以Erastin組為參照,加入CAFs-exo、NFs-exo共培養(yǎng)后,NFs-exo組相較于Erastin組,前列腺癌細胞22rv1和PC-3的遷移、侵襲以及克隆形成數,差異無統計學意義(P>0.05)(圖8～10)。CAFs-exo組相較于Erastin組和NFs-exo組,可促進前列腺癌細胞的遷移(P<0.001)和侵襲(P<0.001)(圖8),細胞遷移能力增加(P<0.01)(圖9),細胞克隆形成數增加(P<0.01)(圖10)。

注:比例尺為100 μm;**為P<0.01,***為 P<0.001,#為P>0.05

注:比例尺為 100 μm;*為 P<0.05,**為 P<0.01,#為P>0.05

注:**P<0.01;#為P>0.05

2.5 CAFs-exo抑制鐵死亡促進上皮間質轉化

用CAFs-exo和NFs-exo分別處理前列腺癌細胞細胞22rv1和PC-3,CAFs-exo組EMT轉化增強,呈現E-cadherin表達水平下降(P<0.01),N-cadherin表達水平增高(P<0.001)、β-catenin表達水平增高(P<0.05)和Vimentin表達水平增高(P<0.001),而NFs-exo組蛋白水平變化,差異無統計學意義(P>0.05)(圖11)。

注:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,#為P>0.05

3 討論

鐵死亡是鐵依賴可調節(jié)性細胞死亡模式,機制特征和細胞凋亡不同。GPX4是谷胱甘肽合成酶的關鍵酶,可通過減少脂質過氧化負調控腫瘤細胞鐵死亡,發(fā)揮促癌作用。最近的研究表明,鐵死亡與前列腺癌病因機制有關,microRNA-214-3p、microRNA-324-3p等一些小分子miRNA被證實可靶向調控GPX4誘發(fā)前列腺癌細胞鐵死亡發(fā)揮抗癌作用[4,7],已成為前列腺癌治療的一種可行方案。

CAFs是腫瘤微環(huán)境中最重要的基質細胞,可通過傳遞核酸、蛋白質等信號分子調控腫瘤發(fā)生和進展。文獻報道,CAFs來源的外泌體可增加Snail表達促進胰腺癌細胞增殖并誘導吉西他濱耐藥[8];在結腸癌中,CAFs外泌體可增強癌細胞干性和上皮-間質轉化促進結腸癌細胞的轉移和化療耐藥[9]。對前列腺癌的研究表明,CAFs外泌體miR-423-5p可通過調控TGF-β信號通路靶向GREM2促進前列腺癌化療耐藥[10],但CAFs外泌體對前列腺癌鐵死亡的影響及與GPX4高表達的關聯性還未可知。

本研究成功分離并原代培養(yǎng)癌組織CAFs和癌旁基質NFs,經免疫熒光實驗和Western blot證實CAFs較NFs高表達α-SMA、FAP和FSP-1特征蛋白;通過超高速離心法分別提取出CAFs-exo和NFs-exo,再分別將CAFs-exo、NFs-exo和Erastin誘導后的22rv1和PC-3細胞共培養(yǎng)。研究發(fā)現,Erastin可誘導22rv1和PC-3細胞出現鐵死亡的特征,表現為細胞內ROS累積、細胞死亡數量增加以及線粒體膜電位的下降。經CAFs-exo共培養(yǎng)處理后,CAFs-exo呈現出顯著抑制Erastin導致的細胞內脂質ROS累積并部分逆轉線粒體膜電位水平的作用,同時細胞死亡率明顯減少;Western blot發(fā)現鐵死亡調控蛋白GPX4表達增高而NRF2、ACSL4水平下調,顯示源于CAFs的外泌體可通過調控鐵死亡機制發(fā)揮促進癌細胞增值的作用,該作用也顯現出22rv1和PC-3細胞遷移以及侵襲能力的增強。本研究結果證實CAFs來源的外泌體確實可通過抑制細胞鐵死亡的機制在前列腺癌疾病進展中發(fā)揮調控作用,而NFs-exo對此無明顯影響。

Wnt/β-catenin信號通路是促進腫瘤上皮-間質轉化進而促進腫瘤進展的主要原因,在多種惡性實體瘤中被發(fā)現有異常激活。研究表明,LncRNA GHET1可調節(jié)AKT/mTOR和Wnt/β-catenin信號通路促進宮頸癌臨床進展[11]。在前列腺癌中,SIRT3可通過Wnt/β-catenin信號通路調控前列腺癌細胞侵襲和轉移[12]。本研究發(fā)現CAFs來源的外泌體與Erastin誘導后的22rv1細胞共培養(yǎng),以Erastin為對照,22rv1細胞呈現E-cadherin表達水平下調而N-cadherin、β-catenin、Vimentin水平上調的現象,NFs外泌體對此無顯著影響。E-cadherin水平的下調顯著增加癌細胞侵襲能力[13],表明CAFs-exo可通過抑制鐵死亡機制促進前列腺癌細胞增強EMT及轉移能力。

綜上所述,本研究初步證實CAFs分泌的外泌體可通過抑制鐵死亡促進前列腺癌細胞增殖、遷移和上皮-間質轉化,是前列腺癌進展的重要調控機制。但具體是何種外泌體通過何種物質發(fā)揮調控作用需進一步分子測序和功能研究。