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        超高效液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜法測定魚肉中4 種四環(huán)素類抗生素

        2023-05-17 03:31:00王雪蓉楊燕紅陳大鵬馬義虔
        養(yǎng)殖與飼料 2023年5期
        關(guān)鍵詞:金霉素土霉素類抗生素

        王雪蓉,楊燕紅,楊 麗,陳大鵬,馬義虔

        貴州省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗檢測院,貴陽 550016

        四環(huán)素類(tetracyclines, TCs)藥物是由放線菌產(chǎn)生的一類基本骨架為并四苯環(huán)的廣譜抗生素[1-2]。四環(huán)素類藥物在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用[3],它對病原菌有抑制作用,也能促進水產(chǎn)動物快速生長。由于缺乏科學(xué)指導(dǎo),導(dǎo)致濫用現(xiàn)象十分嚴重,在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中會有20%~30%的四環(huán)素類藥物被魚類吸收,從而誘導(dǎo)體內(nèi)致病微生物產(chǎn)生抗性基因(antibiotic re sistance genes,ARG),當(dāng)抗性基因通過食物鏈方式進入人體后會對健康構(gòu)成威脅[4-6]。四環(huán)素類抗生素是保障動物和人類健康的重要武器,如果長期食用含四環(huán)素類抗生素殘留的水產(chǎn)品,可能會產(chǎn)生致癌致畸致突變、過敏反應(yīng)和降低人體免疫能力的危害等[7-8]。因此,世界各國對水產(chǎn)品中的獸藥殘留限量做了嚴格規(guī)定,我國規(guī)定魚組織(皮和肉)中土霉素、金霉素和四環(huán)素的最大殘留量為200 μg/kg[9]。

        四環(huán)素類抗生素的檢測方法有:微生物法[10]、免疫分析法[11]、分光光度法[12]、高效液相色譜法[13]和液質(zhì)聯(lián)用法[14-17]等。微生物法只能測定四環(huán)素類抗生素總量,酶聯(lián)免疫法只能測定個別四環(huán)素類抗生素[13,18],高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法靈敏度高、準確度高,且儀器分析時間短,適用于多種抗生素藥物殘留的同時分析。本研究使用Na2EDTA-Mcllvaine 緩沖溶液提取,Oasis HLB 固相萃取小柱凈化,結(jié)合UPLCMS/MS 測定魚中4 種四環(huán)素類(四環(huán)素、金霉素、土霉素、強力霉素)抗生素的方法,為魚肉中四環(huán)素類抗生素的測定提供一種準確、可靠的方法。

        1 材料與方法

        1.1 儀器與設(shè)備

        AcQuity H/Xevo TQ-XS 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀,Waters 公司;H1850 離心機,湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司;MultiReax 渦旋振蕩器,Heielolph公司;Chorusl 超純水系統(tǒng),英國Elga;ME1002TE 電子天平,德國Mettler。

        1.2 材料與試劑

        檸檬酸、磷酸氫二鈉、乙二胺四乙酸二鈉、鹽酸、氫氧化鈉、醋酸鉛、甲酸、甲醇、乙酸乙酯、乙腈均購買于國藥試劑。

        標準品:鹽酸金霉素、鹽酸土霉素、鹽酸四環(huán)素、鹽酸多西環(huán)素,純度均≥95%。

        Na2EDTA-Mcllvaine 緩沖溶液(0.1 mol/L):取乙二胺四乙酸二鈉37.2 g、檸檬酸12.9 g、磷酸氫二鈉10.9 g,加水溶解并定容至1 000 mL,用HCl 或NaOH調(diào)pH 值至4.0±0.05。醋酸鉛溶液(20.0 g/L):取醋酸鉛20.0 g,加水溶解并定容至1 000 mL。甲醇-乙酸乙酯:取甲醇10 mL、乙酸乙酯90 mL,搖勻。0.1%甲酸溶液-乙腈:取0.1%甲酸溶液90 mL、乙腈10 mL,搖勻。

        1.3 試驗方法

        1)標準溶液的配制。①4 種抗生素單標儲備液配制:準確稱取4 種抗生素標準品用甲醇定容至10 mL,配制成質(zhì)量濃度為1 000.0 μg/mL 單標儲備液。

        ②4 種抗生素混標中間液配制:分別移取0.1 mL 4 種四環(huán)素類抗生素儲備液于容量瓶中,用甲醇定容至10 mL,配制成10 μg/mL 混標中間液。

        ③4 種抗生素混標使用液配制:分別吸取0、2、5、10、20、50、100 μL 混標中間液,用空白基質(zhì)溶液定容至10 mL,配制0、2、5、10、20、50、100 ng/mL 的混標使用液。

        2)樣品前處理。

        ①樣品制備:魚肉樣品切碎,用均質(zhì)儀搗碎均質(zhì),混勻后,四分法取樣。

        ②提?。悍Q量2 g 樣品于離心管中,加Na2EDTA-Mcllvaine 緩沖溶液6 mL、醋酸鉛溶液2 mL,渦旋混勻2 min,超聲提取20 min,4 ℃條件下8 000 r/min 離心5 min,取上清液。重復(fù)提取2 次,合并3次提取液。

        ③凈化:Oasis HLB 固相萃取柱依次用甲醇、水各5 mL 進行活化,取提取液10.0 mL 過柱,過完后用水、甲醇溶液各5 mL 淋洗小柱,棄去流出液,減壓抽干5 min。甲醇-乙酸乙酯5 mL 洗脫,洗脫液于40 ℃下氮氣吹至近干,加0.1%甲酸溶液-乙腈1.0 mL 溶解殘渣,渦旋混勻,過0.22 μm 濾膜,待測。

        3)液相條件。色譜柱:ACQUITY UPLCRBEH C18 (2.1 mm×50 mm,1.7 μm);流速:0.35 mL/min;進樣量:1 μL;柱溫:40 ℃;流動相:A 為0.1%甲酸水,B 為乙腈;梯度洗脫程序見表1。

        表1 四環(huán)素類的流動相梯度洗脫

        4)質(zhì)譜條件。電離方式:電噴霧ESI;掃描方式:正離子掃描;檢測方式:多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式;霧化氣流速:1 000 L/h;錐孔氣流速:150 L/h;脫溶劑氣流速:200 L/h;毛細管電壓:4 200 V;離子源溫度:350 ℃;質(zhì)譜條件見表2。

        表2 質(zhì)譜條件

        2 結(jié)果與分析

        2.1 線性方程和檢出限

        本試驗采用添加空白基質(zhì)溶液對4 種混標溶液進行定量測定。4 種四環(huán)素類混合標準溶液的定量離子MRM 色譜見圖1。

        圖1 四環(huán)素類抗生素混合標準溶液的MRM 色譜(質(zhì)量濃度10 ng/mL)

        由表3 可知:4 種四環(huán)素類(四環(huán)素、金霉素、土霉素、強力霉素)抗生素在0~100 ng/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)均大于0.999。

        表3 四環(huán)素類抗生素線性方程和相關(guān)系數(shù)

        2.2 方法回收率和精密度

        選取陰性的魚肉樣品,分別加入3 個水平(5.0、10.0、50.0 μg/kg)的四環(huán)素類抗生素標準溶液,按照本文“1.3”中的條件進行加標回收試驗,結(jié)果見表4。由表4 可知:多西環(huán)素、土霉素、四環(huán)素、金霉素的回收率范圍分別為85.6%~97.7%、89.3%~93.0%、84.2%~97.1%、87.6%~94.2%,精密度RSD 范圍分別為0.9%~1.3% 、0.2%~1.7% 、0.4% ~7.5% 、1.0% ~1.2%。研究表明,4 種四環(huán)素類抗生素回收率均在70%~120%,相對標準偏差RSD≤10%,滿足GB/T 27404—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》對回收率60%~120%、精密度<15%的要求,說明該方法具有較好的準確性和穩(wěn)定性,可以用于魚肉中四環(huán)素類抗生素的測定。

        表4 四環(huán)素類抗生素的回收率和精密度

        2.3 方法檢出限

        方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ)為產(chǎn)生3 倍和10 倍信噪比(S/N)時磺胺類化合物的質(zhì)量濃度。四環(huán)素類抗生素檢出限為5.0 μg/kg,定量限為10.0 μg/kg,而國標GB 31656.11—2021《食品安全國家標準 水產(chǎn)品中土霉素、四環(huán)素、金霉素和多西環(huán)素殘留量的測定》中多西環(huán)素、土霉素、四環(huán)素、金霉素的檢測限分別為20.0、10.0、10.0、20.0 μg/kg,定量限分別為40.0、20.0、20.0、40.0 μg/kg,表明該方法的4 種四環(huán)素類抗生素的檢出限和定量限均低于國標給定值,可以測定出更低濃度的含四環(huán)素類抗生素樣品。

        2.4 樣品測定

        2022 年采用該方法對45 批次魚肉樣品進行測定,檢出四環(huán)素3 批次和金霉素4 批次,含量范圍分別為10.20~30.34、15.60~41.87 μg/kg,GB 31650—2019《食品安全國家標準 食品中獸藥最大殘留限量》規(guī)定四環(huán)素和金霉素限量值為100 μg/kg,所有樣品均在限量值范圍內(nèi),說明這45 批次魚肉樣品不會對消費者身體健康帶來危害。

        3 結(jié) 論

        魚肉中四環(huán)素類藥物的檢測對人類的健康非常重要,本研究建立了魚肉中4 種四環(huán)素類抗生素(四環(huán)素、金霉素、土霉素、強力霉素)的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法。以Na2EDTA-Mcllvaine 緩沖溶液提取、Oasis HLB 固相萃取小柱凈化,通過加標回收率試驗表明:回收率均在70%~120%、相對標準偏差RSD≤10%,4 種四環(huán)素類抗生素檢出限均為5.0 μg/kg,定量限為10.0 μg/kg,滿足GB/T 27404—2008 對回收率60%~120%、精密度<15%的要求,說明該方法靈敏度高、準確性高和穩(wěn)定性好,可用于魚肉中4 種四環(huán)素類藥物的測定。

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