楊應(yīng)勇,劉杰,楊勇,梁妍**,周威**

(1.貴州神奇藥業(yè)有限公司 貴州神奇藥物研究院,貴州 貴陽(yáng) 550004;2.貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院,貴州 貴陽(yáng) 550025)

鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)為蘭科屬名貴藥用植物,其主要的化學(xué)成分有聯(lián)芐、菲類(lèi)、生物堿、多糖等[1],研究表明鐵皮石斛具有抗腫瘤、降糖、增強(qiáng)免疫力等藥理活性[2-4]。肺癌是全球發(fā)病率最高的癌癥,超過(guò)75%的肺癌患者會(huì)發(fā)展為晚期,5年生存率僅為5.2%。本課題組前期實(shí)驗(yàn)證明鐵皮石斛提取物對(duì)人肺癌細(xì)胞的增殖具有明顯抑制作用,且下調(diào)肺癌細(xì)胞能量代謝途徑上游調(diào)控蛋白[5-7]。腫瘤細(xì)胞或組織表現(xiàn)出異常的能量代謝,即使是在氧氣充足的條件下,快速生長(zhǎng)的癌細(xì)胞仍依賴糖酵解來(lái)產(chǎn)生能量,這種獨(dú)特的供能方式被稱(chēng)為瓦博格效應(yīng)(warburg effect)或有氧糖酵解[8-10],這種異常的能量代謝方式被認(rèn)為是腫瘤的標(biāo)志之一,在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用,抑制糖酵解途徑能為新型抗癌藥物的研究開(kāi)發(fā)提供有效途徑[11-12]。鐵皮石斛對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、臨床患者體內(nèi)血糖水平平衡有良好的調(diào)控作用[13-15],鑒于此,本研究將從腫瘤糖酵解角度研究分析鐵皮石斛抗肺癌的體內(nèi)外作用及機(jī)制,為其開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1細(xì)胞株和動(dòng)物 人肺癌A549細(xì)胞、小鼠肺癌LLC細(xì)胞由武漢益普生物科技有限公司提供。SPF級(jí)C57BL/6J雄性小鼠(6周齡,體質(zhì)量18～20 g)購(gòu)自貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[動(dòng)物證書(shū)編號(hào)SCXK(北京) 2019-0008]。

1.1.2藥品與試劑 鐵皮石斛購(gòu)自貴陽(yáng)太升中藥材市場(chǎng),經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)生藥學(xué)教研室劉紹歡副教授鑒定為蘭科石斛屬植物鐵皮石斛,注射用環(huán)磷酰胺 (CTX,德國(guó)Baxter Oncology GmbH公司),RPMI 1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基和0.25%胰蛋白酶-EDTA酶購(gòu)自Gibco公司,胎牛血清(FBS)購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司,噻唑藍(lán)(MTT)、彩虹180廣譜蛋白Marker、乳酸含量檢測(cè)試劑盒和葡萄糖含量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶公司,葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(glucose transporter 4,GLUT4)、己糖激酶2(hexokinase 2,HK2)、GAPDH和β-Actin購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司,M2型丙酮酸激酶(pyruvate kinase M2,PKM2)購(gòu)自Cell Signaling Technology 公司。

1.2 研究方法

1.2.1鐵皮石斛提取物制備 將1 000 g鐵皮石斛以固液比1∶6浸泡在95 %乙醇中24 h,然后在80 ℃恒溫水浴中乙醇冷凝回流提取3次,每次2 h,收集濾液,將其濃縮成無(wú)醇味浸膏,4℃保存,備用。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng) 人A549肺癌細(xì)胞和小鼠LLC肺癌細(xì)胞分別使用RPMI 1640完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清和1%雙抗)和DMEM安全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清和1%雙抗),置于5% CO2、37 ℃、飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.3MTT比色法檢測(cè)鐵皮石斛提取物對(duì)A549細(xì)胞活力的影響 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞以8×103個(gè)/孔接種于96孔板中,設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后,分別加入0.0、25.0、50.0、100.0、200.0、400.0和800.0 mg/L的鐵皮石斛提取物,0.5%乙醇培養(yǎng)基溶媒作為空白對(duì)照組。進(jìn)一步培養(yǎng)24 h,避光條件下每孔中加入5% MTT溶液15 μL,并將96孔板在37 ℃、5%CO2下繼續(xù)培養(yǎng)4 h。隨后棄去上清液,向每個(gè)孔中加入DMSO液150 μL,避光搖床震搖10 min 以溶解結(jié)晶。酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值(OD)。細(xì)胞活力按公式計(jì)算:細(xì)胞活力(%)=(OD樣品)/(OD空白)×100%。

1.2.4A549細(xì)胞葡萄糖消耗量和乳酸生成量測(cè)定 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞以1×105個(gè)/mL密度接種于24孔板,培養(yǎng)24 h后,給與不同濃度的鐵皮石斛提取物(100.0 mg/L,200.0 mg/L)繼續(xù)培養(yǎng)24 h,收集培養(yǎng)基。依據(jù)葡萄糖測(cè)定試劑盒和乳酸含量檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明測(cè)定不同組別A549細(xì)胞中葡萄糖消耗量和乳酸生成量。

1.2.5鐵皮石斛提取物抑制LLC肺癌荷瘤小鼠腫瘤 SPF級(jí)雄性C57小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠肺腺癌LLC細(xì)胞用PBS溶液制成細(xì)胞濃度為1×107個(gè)/mL的細(xì)胞懸液,用一次性無(wú)菌注射器抽取0.15 mL 細(xì)胞懸液接種于C57小鼠右前肢腋窩皮下;待瘤體直徑達(dá)到100 mm3時(shí)隨機(jī)分組,設(shè)置0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶媒模型對(duì)照組、鐵皮石斛低劑量組(200.0 mg/kg)、鐵皮石斛高劑量組(400.0 mg/kg)、CTX陽(yáng)性對(duì)照組(40.0 mg/kg),連續(xù)給藥14 d,每天1次。實(shí)驗(yàn)期間每天密切觀察小鼠的精神狀態(tài)、飲食、活動(dòng)情況和行為學(xué)變化,期間小鼠自由飲食。每天1次稱(chēng)量小鼠體質(zhì)量和采用游標(biāo)卡尺測(cè)量瘤塊最長(zhǎng)徑a(mm)和最短徑b(mm),計(jì)算腫瘤體積:V(mm3)=1/2×(a×b2),繪制小鼠體質(zhì)量變化曲線和腫瘤生長(zhǎng)曲線。

1.2.6Western blot檢測(cè)GLUT4、HK2和PKM2蛋白表達(dá)水平 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的A549細(xì)胞以每孔5×105個(gè)/mL密度接種在6孔板中,培養(yǎng)24 h后,給與A549細(xì)胞不同濃度的鐵皮石斛提取物(100.0 mg/L,200.0 mg/L)24 h,用預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞2次并加入80 μL細(xì)胞裂解液,細(xì)胞刮刀冰上提取蛋白,12 000 r/min離心取上清,BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定總蛋白濃度。取約50 mg腫瘤組織,剪碎置于離心管中,加入200 μL組織裂解液,勻漿器勻漿至組織完全裂解,冰上裂解10 min,12 000 r/min離心取上清,BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定總蛋白濃度。20 μg總蛋白在10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)上電泳分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,5%脫脂牛奶封閉膜1 h,TBST洗滌3次,每次5 min,以1∶1 000的稀釋度依次加入一抗,分別GLUT4、HK2、PKM2,并在4 ℃孵育過(guò)夜。然后,在室溫下將膜與二抗孵育1 h。最后,滴加增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)顯色,蛋白質(zhì)信號(hào)使用BIORAD成像系統(tǒng)成像。用GLUT4、HK2和PKM2目的樣本條帶與內(nèi)參條帶積分光密度比值表示目的蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 A549細(xì)胞的增殖

人肺癌A549細(xì)胞經(jīng)不同濃度鐵皮石斛提取物處理24 h后,MTT結(jié)果顯示,鐵皮石斛提取物能夠明顯抑制A549細(xì)胞的增殖,且呈劑量依賴性(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

注:與空白組比較,(1)P<0.01,(2)P<0.001。圖1 鐵皮石斛提取物對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Effects of Dendrobium officinale extract on A549 cells proliferation

2.2 A549細(xì)胞葡萄糖消耗量和乳酸生成量

如圖2所示,與空白對(duì)照組相比,鐵皮石斛提取物組的葡萄糖消耗量和乳酸生成量均降低(P<0.05),提示鐵皮石斛提取物能夠抑制A549肺癌細(xì)胞糖酵解,從而發(fā)揮抑制肺癌細(xì)胞增殖的作用。

注: (1) 與空白組比較,P<0.05;(2)與空白組比較,P<0.01。圖2 鐵皮石斛提取物對(duì)A549細(xì)胞葡萄糖消耗量、乳酸生成量的影響Fig.2 Effects of Dendrobium officinale extract on glucose consumption and lactate production in A549 cells

2.3 荷瘤小鼠體質(zhì)量和瘤體變化

連續(xù)給藥14 d后,各組肺癌荷瘤小鼠的體質(zhì)量變化見(jiàn)圖3。與模型對(duì)照組比較,鐵皮石斛提取物給藥組LLC肺癌荷瘤小鼠體質(zhì)量無(wú)明顯變化,CTX陽(yáng)性對(duì)照組的小鼠體質(zhì)量急劇降低,表明鐵皮石斛提取物具有毒副作用低、安全性高的特點(diǎn),圖4結(jié)果顯示200.0 mg/kg、400.0 mg/kg的鐵皮石斛提取物對(duì)LLC肺癌荷瘤小鼠瘤體生長(zhǎng)具有明顯抑制作用。

注:(1) 與模型組比較,P<0.05。圖3 鐵皮石斛提取物對(duì)荷瘤小鼠體質(zhì)量影響的變化曲線Fig.3 Changes of body weight of tumor-bearing mice under the effect of Dendrobium officinale extract

注:與模型組比較,(1)P<0.05,(2)P<0.01。圖4 鐵皮石斛提取物對(duì)荷瘤小鼠腫瘤組織體積的影響Fig.4 Changes of lung tumor tissue size of tumor-bearing mice under the effect of Dendrobium officinale extract

2.4 A549細(xì)胞與荷瘤小鼠腫瘤組織中GLUT4、HK2和PKM 2蛋白表達(dá)

給予100.0 mg/L和200.0 mg/L的鐵皮石斛提取物處理A549細(xì)胞24 h后,Western blotting 檢測(cè)結(jié)果表明,與空白對(duì)照組比較,鐵皮石斛提取物呈劑量依賴方式抑制GLUT4和HK2蛋白的表達(dá)(P<0.05),但各組細(xì)胞中PKM2蛋白表達(dá)未發(fā)生變化(P>0.05)。見(jiàn)圖5。灌胃給予LLC肺癌荷瘤小鼠200.0 mg/kg和400.0 mg/kg鐵皮石斛提取物,荷瘤小鼠腫瘤組織中GLUT4和HK2蛋白的表達(dá)下調(diào)(P<0.05)。見(jiàn)圖6。

注:與空白組比較,(1)P<0.05,(2)P<0.01。圖5 鐵皮石斛提取物對(duì)A549細(xì)胞中GLUT4、HK2和PKM2蛋白表達(dá)水平的影響Fig.5 Effect of Dendrobium officinale extract on the expression level of GLUT4,HK2,and PKM2 protein of A549 cells

注:與模型組比較,(1)P<0.01,(2)P<0.05。圖6 鐵皮石斛提取物對(duì)荷瘤小鼠腫瘤組織中GLUT4、HK2和PKM2蛋白表達(dá)水平的影響Fig.6 Effects of Dendrobium officinale extract on the expression level of GLUT4,HK2,and PKM2 protein of tumor tissues in tumor-bearing mice

3 討論

大多數(shù)腫瘤疾病的特征是葡萄糖消耗和乳酸分泌大量增加。在小鼠和人類(lèi)中的研究已經(jīng)證實(shí),乳酸被癌細(xì)胞再循環(huán)利用,由此產(chǎn)生的酸性環(huán)境對(duì)腫瘤生物學(xué)、血管生成、局部侵襲、轉(zhuǎn)移以及抗癌免疫具有廣泛的影響,這為癌癥的治療提供了潛在的治療靶點(diǎn)和策略。鐵皮石斛提取物干預(yù)A549細(xì)胞24 h后,葡萄糖消耗量和乳酸生成量明顯降低,提示鐵皮石斛提取物影響肺癌細(xì)胞能量代謝[16-17]。

非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展與葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和糖酵解限速酶密切相關(guān),尤其是GLUT4、HK2和PKM2,已有研究證實(shí)靶向葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和糖酵解限速酶對(duì)人非小細(xì)胞肺癌的治療具有積極作用[18-20]。GLUT4通過(guò)自身的構(gòu)象改變從細(xì)胞內(nèi)膜易位至細(xì)胞外膜,即為GLUT 4的轉(zhuǎn)位。腫瘤細(xì)胞通過(guò)活化或者增加GLUT4 的轉(zhuǎn)位和表達(dá)攝取足夠的葡萄糖,產(chǎn)生能量來(lái)實(shí)現(xiàn)其快速增殖,GLUT4是腫瘤糖酵解中的重要蛋白,是非小細(xì)胞肺癌治療中潛在的代謝靶向目標(biāo)。己糖激酶 (HKs) 是催化葡萄糖代謝限速酶,以4種亞型HK1～HK4存在,HK2在癌癥中過(guò)度表達(dá),在腫瘤生長(zhǎng)、存活和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。丙酮酸激酶(PK)存在4種異構(gòu)體,包括PKL、PKR、PKM1和PKM2,腫瘤細(xì)胞主要依賴PKM2發(fā)揮作用。

0.5%乙醇、0.5% CMC-Na被廣泛用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的藥物配置和實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,它們作為常用溶媒是非常安全的,對(duì)相關(guān)實(shí)驗(yàn)沒(méi)有影響。本次預(yù)實(shí)驗(yàn)也考察核實(shí)了兩者的良好助溶性和安全性。本實(shí)驗(yàn)Western blot法檢測(cè)鐵皮石斛提取物干預(yù)A549細(xì)胞后,GLUT4和HK2表達(dá)呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì),PKM2表達(dá)無(wú)明顯變化,表明鐵皮石斛提取物通過(guò)抑制GLUT4和HK2的表達(dá),從而降低肺癌A549細(xì)胞對(duì)葡萄糖吸收和乳酸生成,致使肺癌A549細(xì)胞能量代謝發(fā)生異常。與肺癌荷瘤小鼠模型相比,給予鐵皮石斛提取物組的瘤體體積減小,小鼠體質(zhì)量未見(jiàn)顯著降低,鐵皮石斛提取物實(shí)驗(yàn)組的小鼠腫瘤組織GLUT4和HK2顯著下調(diào),PKM2蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化,該規(guī)律與人A549細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致,表明鐵皮石斛提取物能夠抑制人肺癌A549細(xì)胞增殖、小鼠LLC肺癌荷瘤小鼠體內(nèi)瘤體生長(zhǎng),其抗腫瘤作用機(jī)制可能是調(diào)控了肺癌有氧糖酵解的GLUT4和HK2關(guān)鍵蛋白表達(dá)。相對(duì)于陽(yáng)性藥物,鐵皮石斛用藥安全性好,具有較好的藥物開(kāi)發(fā)前景。