楊應勇,劉杰,楊勇,梁妍**,周威**

(1.貴州神奇藥業(yè)有限公司 貴州神奇藥物研究院,貴州 貴陽 550004;2.貴州醫(yī)科大學 藥學院,貴州 貴陽 550025)

鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)為蘭科屬名貴藥用植物,其主要的化學成分有聯(lián)芐、菲類、生物堿、多糖等[1],研究表明鐵皮石斛具有抗腫瘤、降糖、增強免疫力等藥理活性[2-4]。肺癌是全球發(fā)病率最高的癌癥,超過75%的肺癌患者會發(fā)展為晚期,5年生存率僅為5.2%。本課題組前期實驗證明鐵皮石斛提取物對人肺癌細胞的增殖具有明顯抑制作用,且下調(diào)肺癌細胞能量代謝途徑上游調(diào)控蛋白[5-7]。腫瘤細胞或組織表現(xiàn)出異常的能量代謝,即使是在氧氣充足的條件下,快速生長的癌細胞仍依賴糖酵解來產(chǎn)生能量,這種獨特的供能方式被稱為瓦博格效應(warburg effect)或有氧糖酵解[8-10],這種異常的能量代謝方式被認為是腫瘤的標志之一,在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移中起關鍵作用,抑制糖酵解途徑能為新型抗癌藥物的研究開發(fā)提供有效途徑[11-12]。鐵皮石斛對實驗動物、臨床患者體內(nèi)血糖水平平衡有良好的調(diào)控作用[13-15],鑒于此,本研究將從腫瘤糖酵解角度研究分析鐵皮石斛抗肺癌的體內(nèi)外作用及機制,為其開發(fā)應用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1細胞株和動物 人肺癌A549細胞、小鼠肺癌LLC細胞由武漢益普生物科技有限公司提供。SPF級C57BL/6J雄性小鼠(6周齡,體質(zhì)量18～20 g)購自貴州醫(yī)科大學動物實驗中心[動物證書編號SCXK(北京) 2019-0008]。

1.1.2藥品與試劑 鐵皮石斛購自貴陽太升中藥材市場,經(jīng)貴州醫(yī)科大學生藥學教研室劉紹歡副教授鑒定為蘭科石斛屬植物鐵皮石斛,注射用環(huán)磷酰胺 (CTX,德國Baxter Oncology GmbH公司),RPMI 1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基和0.25%胰蛋白酶-EDTA酶購自Gibco公司,胎牛血清(FBS)購自武漢普諾賽生命科技有限公司,噻唑藍(MTT)、彩虹180廣譜蛋白Marker、乳酸含量檢測試劑盒和葡萄糖含量檢測試劑盒購自北京索萊寶公司,葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4(glucose transporter 4,GLUT4)、己糖激酶2(hexokinase 2,HK2)、GAPDH和β-Actin購自武漢三鷹生物技術有限公司,M2型丙酮酸激酶(pyruvate kinase M2,PKM2)購自Cell Signaling Technology 公司。

1.2 研究方法

1.2.1鐵皮石斛提取物制備 將1 000 g鐵皮石斛以固液比1∶6浸泡在95 %乙醇中24 h,然后在80 ℃恒溫水浴中乙醇冷凝回流提取3次,每次2 h,收集濾液,將其濃縮成無醇味浸膏,4℃保存,備用。

1.2.2細胞培養(yǎng) 人A549肺癌細胞和小鼠LLC肺癌細胞分別使用RPMI 1640完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清和1%雙抗)和DMEM安全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清和1%雙抗),置于5% CO2、37 ℃、飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.3MTT比色法檢測鐵皮石斛提取物對A549細胞活力的影響 將對數(shù)生長期的A549細胞以8×103個/孔接種于96孔板中,設置5個復孔。培養(yǎng)24 h后,分別加入0.0、25.0、50.0、100.0、200.0、400.0和800.0 mg/L的鐵皮石斛提取物,0.5%乙醇培養(yǎng)基溶媒作為空白對照組。進一步培養(yǎng)24 h,避光條件下每孔中加入5% MTT溶液15 μL,并將96孔板在37 ℃、5%CO2下繼續(xù)培養(yǎng)4 h。隨后棄去上清液,向每個孔中加入DMSO液150 μL,避光搖床震搖10 min 以溶解結晶。酶標儀于490 nm波長下測定吸光度值(OD)。細胞活力按公式計算:細胞活力(%)=(OD樣品)/(OD空白)×100%。

1.2.4A549細胞葡萄糖消耗量和乳酸生成量測定 將對數(shù)生長期的A549細胞以1×105個/mL密度接種于24孔板,培養(yǎng)24 h后,給與不同濃度的鐵皮石斛提取物(100.0 mg/L,200.0 mg/L)繼續(xù)培養(yǎng)24 h,收集培養(yǎng)基。依據(jù)葡萄糖測定試劑盒和乳酸含量檢測試劑盒操作說明測定不同組別A549細胞中葡萄糖消耗量和乳酸生成量。

1.2.5鐵皮石斛提取物抑制LLC肺癌荷瘤小鼠腫瘤 SPF級雄性C57小鼠適應性喂養(yǎng)1周后,將對數(shù)生長期的小鼠肺腺癌LLC細胞用PBS溶液制成細胞濃度為1×107個/mL的細胞懸液,用一次性無菌注射器抽取0.15 mL 細胞懸液接種于C57小鼠右前肢腋窩皮下;待瘤體直徑達到100 mm3時隨機分組,設置0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶媒模型對照組、鐵皮石斛低劑量組(200.0 mg/kg)、鐵皮石斛高劑量組(400.0 mg/kg)、CTX陽性對照組(40.0 mg/kg),連續(xù)給藥14 d,每天1次。實驗期間每天密切觀察小鼠的精神狀態(tài)、飲食、活動情況和行為學變化,期間小鼠自由飲食。每天1次稱量小鼠體質(zhì)量和采用游標卡尺測量瘤塊最長徑a(mm)和最短徑b(mm),計算腫瘤體積:V(mm3)=1/2×(a×b2),繪制小鼠體質(zhì)量變化曲線和腫瘤生長曲線。

1.2.6Western blot檢測GLUT4、HK2和PKM2蛋白表達水平 將對數(shù)生長的A549細胞以每孔5×105個/mL密度接種在6孔板中,培養(yǎng)24 h后,給與A549細胞不同濃度的鐵皮石斛提取物(100.0 mg/L,200.0 mg/L)24 h,用預冷的PBS清洗細胞2次并加入80 μL細胞裂解液,細胞刮刀冰上提取蛋白,12 000 r/min離心取上清,BCA蛋白測定試劑盒測定總蛋白濃度。取約50 mg腫瘤組織,剪碎置于離心管中,加入200 μL組織裂解液,勻漿器勻漿至組織完全裂解,冰上裂解10 min,12 000 r/min離心取上清,BCA蛋白測定試劑盒測定總蛋白濃度。20 μg總蛋白在10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)上電泳分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,5%脫脂牛奶封閉膜1 h,TBST洗滌3次,每次5 min,以1∶1 000的稀釋度依次加入一抗,分別GLUT4、HK2、PKM2,并在4 ℃孵育過夜。然后,在室溫下將膜與二抗孵育1 h。最后,滴加增強化學發(fā)光試劑(ECL)顯色,蛋白質(zhì)信號使用BIORAD成像系統(tǒng)成像。用GLUT4、HK2和PKM2目的樣本條帶與內(nèi)參條帶積分光密度比值表示目的蛋白表達水平。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 A549細胞的增殖

人肺癌A549細胞經(jīng)不同濃度鐵皮石斛提取物處理24 h后,MTT結果顯示,鐵皮石斛提取物能夠明顯抑制A549細胞的增殖,且呈劑量依賴性(P<0.05)。見圖1。

注:與空白組比較,(1)P<0.01,(2)P<0.001。圖1 鐵皮石斛提取物對A549細胞增殖的影響Fig.1 Effects of Dendrobium officinale extract on A549 cells proliferation

2.2 A549細胞葡萄糖消耗量和乳酸生成量

如圖2所示,與空白對照組相比,鐵皮石斛提取物組的葡萄糖消耗量和乳酸生成量均降低(P<0.05),提示鐵皮石斛提取物能夠抑制A549肺癌細胞糖酵解,從而發(fā)揮抑制肺癌細胞增殖的作用。

注: (1) 與空白組比較,P<0.05;(2)與空白組比較,P<0.01。圖2 鐵皮石斛提取物對A549細胞葡萄糖消耗量、乳酸生成量的影響Fig.2 Effects of Dendrobium officinale extract on glucose consumption and lactate production in A549 cells

2.3 荷瘤小鼠體質(zhì)量和瘤體變化

連續(xù)給藥14 d后,各組肺癌荷瘤小鼠的體質(zhì)量變化見圖3。與模型對照組比較,鐵皮石斛提取物給藥組LLC肺癌荷瘤小鼠體質(zhì)量無明顯變化,CTX陽性對照組的小鼠體質(zhì)量急劇降低,表明鐵皮石斛提取物具有毒副作用低、安全性高的特點,圖4結果顯示200.0 mg/kg、400.0 mg/kg的鐵皮石斛提取物對LLC肺癌荷瘤小鼠瘤體生長具有明顯抑制作用。

注:(1) 與模型組比較,P<0.05。圖3 鐵皮石斛提取物對荷瘤小鼠體質(zhì)量影響的變化曲線Fig.3 Changes of body weight of tumor-bearing mice under the effect of Dendrobium officinale extract

注:與模型組比較,(1)P<0.05,(2)P<0.01。圖4 鐵皮石斛提取物對荷瘤小鼠腫瘤組織體積的影響Fig.4 Changes of lung tumor tissue size of tumor-bearing mice under the effect of Dendrobium officinale extract

2.4 A549細胞與荷瘤小鼠腫瘤組織中GLUT4、HK2和PKM 2蛋白表達

給予100.0 mg/L和200.0 mg/L的鐵皮石斛提取物處理A549細胞24 h后,Western blotting 檢測結果表明,與空白對照組比較,鐵皮石斛提取物呈劑量依賴方式抑制GLUT4和HK2蛋白的表達(P<0.05),但各組細胞中PKM2蛋白表達未發(fā)生變化(P>0.05)。見圖5。灌胃給予LLC肺癌荷瘤小鼠200.0 mg/kg和400.0 mg/kg鐵皮石斛提取物,荷瘤小鼠腫瘤組織中GLUT4和HK2蛋白的表達下調(diào)(P<0.05)。見圖6。

注:與空白組比較,(1)P<0.05,(2)P<0.01。圖5 鐵皮石斛提取物對A549細胞中GLUT4、HK2和PKM2蛋白表達水平的影響Fig.5 Effect of Dendrobium officinale extract on the expression level of GLUT4,HK2,and PKM2 protein of A549 cells

注:與模型組比較,(1)P<0.01,(2)P<0.05。圖6 鐵皮石斛提取物對荷瘤小鼠腫瘤組織中GLUT4、HK2和PKM2蛋白表達水平的影響Fig.6 Effects of Dendrobium officinale extract on the expression level of GLUT4,HK2,and PKM2 protein of tumor tissues in tumor-bearing mice

3 討論

大多數(shù)腫瘤疾病的特征是葡萄糖消耗和乳酸分泌大量增加。在小鼠和人類中的研究已經(jīng)證實,乳酸被癌細胞再循環(huán)利用,由此產(chǎn)生的酸性環(huán)境對腫瘤生物學、血管生成、局部侵襲、轉(zhuǎn)移以及抗癌免疫具有廣泛的影響,這為癌癥的治療提供了潛在的治療靶點和策略。鐵皮石斛提取物干預A549細胞24 h后,葡萄糖消耗量和乳酸生成量明顯降低,提示鐵皮石斛提取物影響肺癌細胞能量代謝[16-17]。

非小細胞肺癌的發(fā)生發(fā)展與葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白和糖酵解限速酶密切相關,尤其是GLUT4、HK2和PKM2,已有研究證實靶向葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白和糖酵解限速酶對人非小細胞肺癌的治療具有積極作用[18-20]。GLUT4通過自身的構象改變從細胞內(nèi)膜易位至細胞外膜,即為GLUT 4的轉(zhuǎn)位。腫瘤細胞通過活化或者增加GLUT4 的轉(zhuǎn)位和表達攝取足夠的葡萄糖,產(chǎn)生能量來實現(xiàn)其快速增殖,GLUT4是腫瘤糖酵解中的重要蛋白,是非小細胞肺癌治療中潛在的代謝靶向目標。己糖激酶 (HKs) 是催化葡萄糖代謝限速酶,以4種亞型HK1～HK4存在,HK2在癌癥中過度表達,在腫瘤生長、存活和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。丙酮酸激酶(PK)存在4種異構體,包括PKL、PKR、PKM1和PKM2,腫瘤細胞主要依賴PKM2發(fā)揮作用。

0.5%乙醇、0.5% CMC-Na被廣泛用于細胞實驗、動物實驗的藥物配置和實驗過程中,它們作為常用溶媒是非常安全的,對相關實驗沒有影響。本次預實驗也考察核實了兩者的良好助溶性和安全性。本實驗Western blot法檢測鐵皮石斛提取物干預A549細胞后,GLUT4和HK2表達呈現(xiàn)下調(diào)趨勢,PKM2表達無明顯變化,表明鐵皮石斛提取物通過抑制GLUT4和HK2的表達,從而降低肺癌A549細胞對葡萄糖吸收和乳酸生成,致使肺癌A549細胞能量代謝發(fā)生異常。與肺癌荷瘤小鼠模型相比,給予鐵皮石斛提取物組的瘤體體積減小,小鼠體質(zhì)量未見顯著降低,鐵皮石斛提取物實驗組的小鼠腫瘤組織GLUT4和HK2顯著下調(diào),PKM2蛋白表達無明顯變化,該規(guī)律與人A549細胞實驗結果一致,表明鐵皮石斛提取物能夠抑制人肺癌A549細胞增殖、小鼠LLC肺癌荷瘤小鼠體內(nèi)瘤體生長,其抗腫瘤作用機制可能是調(diào)控了肺癌有氧糖酵解的GLUT4和HK2關鍵蛋白表達。相對于陽性藥物,鐵皮石斛用藥安全性好,具有較好的藥物開發(fā)前景。