黃燕子,喻茂娟,柳青

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院,貴州 貴陽 550004;2.貴陽市云巖區(qū)疾病預(yù)防控制中心 疾控科,貴州 貴陽 550004;3.南通市衛(wèi)生健康委員會(huì) 疾病預(yù)防控制處,江蘇 南通 226000)

地方性燃煤型氟中毒(簡稱燃煤型氟中毒)是由于居民使用高氟煤污染環(huán)境介質(zhì)或食物引起的以氟斑牙和氟骨癥為主要特征的一種慢性全身性疾病[1]。在燃煤氟中毒的機(jī)制研究中,最早且較多屬骨相方面的損害,隨著對(duì)氟中毒研究的深入,近年來研究熱點(diǎn)逐漸轉(zhuǎn)向非骨相改變,尤其是生殖系統(tǒng)方面[2-3]。轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)屬于一類細(xì)胞調(diào)節(jié)因子,在女性生殖系統(tǒng)疾病中,TGF-β1有重要調(diào)節(jié)作用[4-6],動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),TGF-β1不僅能調(diào)控卵巢中卵泡的發(fā)育,而且在機(jī)體免疫-神經(jīng)-內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)中起到了關(guān)鍵作用[7-8],提示TGF-β1與生殖關(guān)系密切。本研究模擬病區(qū)女性持續(xù)氟暴露情況,建立雌鼠燃煤型氟中毒模型,通過檢測(cè)雌鼠下丘腦-垂體-卵巢中TGF-β1表達(dá)情況,探討氟對(duì)雌性大鼠下丘腦-垂體-卵巢功能軸的影響及其可能機(jī)制,進(jìn)一步為防治燃煤氟所致女性生殖系統(tǒng)損害提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康的清潔級(jí)雌性SD大鼠120只,由貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供,鼠齡28 d,體質(zhì)量60～80 g,研究獲學(xué)校倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(編號(hào)1603185)。

1.1.2主要儀器與試劑 Nikon TE2000-U倒置顯微鏡(日本尼康公司),Leica RM2135型切片機(jī)(德國Leica公司)。氟化鈉(分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),TGF-β1、一抗體、二抗、DAB顯色劑(天津市科密歐化工有限公司)。

1.2 研究方法

SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,參考文獻(xiàn)[9-10]測(cè)定飼料中氟元素含量為(10.38±0.41)mg/kg、自來水氟元素濃度為(0.83±0.01)mg/L,均符合非氟中毒地區(qū)食物和飲用水標(biāo)準(zhǔn)。大鼠按體質(zhì)量從小到大排列,采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為對(duì)照組、低氟組、中氟組和高氟組,每組30只,對(duì)照組大鼠給予正常飼料,低、中、高氟組分別用25、50、100 mg/kg的含氟飼料喂養(yǎng)[11-13]。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1尿氟檢測(cè) 染氟第3、4、5個(gè)月時(shí),將待處理的10只SD大鼠放入代謝籠中收集其24 h尿液,采用氟離子選擇電極法測(cè)定尿氟離子濃度,參照標(biāo)準(zhǔn)為《尿中氟的離子選擇電極測(cè)定方法》(WS/T30-1996)。

1.3.2骨氟檢測(cè) 染氟第3、4、5個(gè)月時(shí),每組分別處死10只SD大鼠,取其左下肢骨于馬弗爐內(nèi)灰化,采用氟離子選擇電極法測(cè)定骨氟離子濃度,參照標(biāo)準(zhǔn)為《氟離子選擇電極測(cè)定法》(WS/T89-1996)。

1.3.3氟斑牙判定 染氟第5個(gè)月時(shí),判定SD大鼠氟斑牙情況[14-15](正常,牙釉質(zhì)呈半透明、橘黃色或棕黃色,色澤度好;輕度,牙釉質(zhì)出現(xiàn)微小規(guī)模的棕白相間橫紋;中度,牙釉質(zhì)白色橫紋變寬甚至不規(guī)則;重度,牙釉質(zhì)棕色橫紋消失、大部分牙表面呈白粉筆樣)。

1.3.4下丘腦、垂體及卵巢組織臟器系數(shù) 染氟第3、4、5個(gè)月時(shí),每組分別處死10只SD大鼠,分離下丘腦、垂體及卵巢,稱重計(jì)算臟器系數(shù),臟器系數(shù)=組織的臟器質(zhì)量/大鼠體質(zhì)量。

1.3.5下丘腦、垂體及卵巢組織的TGF-β1表達(dá) 染氟第3、4、5個(gè)月時(shí),各組分別處死10只SD大鼠,分離下丘腦、垂體及卵巢,用10 %中性甲醛溶液固定24 h、脫水、浸蠟及切片,免疫組化法測(cè)定下丘腦、垂體及卵巢組織中TGF-β1的表達(dá)情況,同時(shí)采用半定量法進(jìn)行分析,以目標(biāo)區(qū)域染色深淺和面積大小確定靶蛋白的量,染色區(qū)域顏色越深說明所測(cè)蛋白的量越多。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 11.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析,符合正態(tài)分布且方差齊的計(jì)量資料,用單因素方差分析進(jìn)行比較,不同組別之間采用SNK法進(jìn)行兩兩比較;計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料兩兩比較采用Bonferroni法;雙向有序資料采用線性趨勢(shì)檢驗(yàn);檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 大鼠尿氟含量

隨著喂養(yǎng)時(shí)間延長,4組大鼠尿氟含量增加,對(duì)照組大鼠3個(gè)時(shí)間點(diǎn)尿氟比較、差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),而3個(gè)染氟組大鼠尿氟含量組內(nèi)比較、差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與對(duì)照組比較,除低氟組染氟3、4月大鼠尿氟含量無明顯升高外,其余各染氟組及染氟時(shí)間點(diǎn)大鼠的尿氟含量明顯升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)的尿氟濃度Tab.1 Contents of urinary fluoride of each group in different

2.2 大鼠骨氟含量

隨著喂養(yǎng)時(shí)間延長,4組大鼠骨氟含量增加,對(duì)照組大鼠3個(gè)時(shí)間點(diǎn)骨氟比較、差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),而3個(gè)染氟組大鼠骨氟含量組內(nèi)比較、差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與對(duì)照組比較,除低氟組染氟3月大鼠骨氟含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),其余各染氟組及染氟時(shí)間點(diǎn)大鼠的骨氟含量明顯升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)骨氟濃度Tab.2 Contents of bone fluoride of each group in different

2.3 大鼠氟斑牙

2.4 大鼠下丘腦、垂體及卵巢組織臟器系數(shù)

染氟第3個(gè)月時(shí),各染氟組雌性大鼠下丘腦、垂體組織臟器系數(shù)比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05) 。染氟第4、5個(gè)月時(shí),各染氟組雌性大鼠卵巢組織臟器系數(shù)比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),中氟組和高氟組卵巢組織臟器系數(shù)高于同時(shí)間點(diǎn)的對(duì)照組(P<0.05),且高氟組雌性大鼠卵巢組織臟器系數(shù)隨染氟時(shí)間呈上升趨勢(shì)(P<0.05)。見表4～表6。

表3 染氟第5個(gè)月時(shí)SD大鼠的氟斑牙情況(n=10)Tab.3 Degrees of dental fluorosis of rats in 5 months(n=10)

表4 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)下丘腦臟器系數(shù)Tab.4 Changes of hypothalamus organ coefficient of each group in different

表5 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)垂體臟器系數(shù)Tab.5 Changes of pituitary organ coefficients of each group in different

表6 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)卵巢臟器系數(shù)Tab.6 Changes of the right ovarian organ coefficients of each group in different

2.5 下丘腦、垂體及卵巢組織TGF-β1的表達(dá)

2.5.1下丘腦中TGF-β1的表達(dá) 染氟第5個(gè)月時(shí),各染氟組下丘腦組織TGF-β1表達(dá)比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與對(duì)照組相比較,各染氟組中TGF-β1表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),并隨染氟劑量增加有上升趨勢(shì),但同一染氟組TGF-β1表達(dá)水平隨染氟時(shí)間先降后升(P<0.05)。見表7、圖1。

表7 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)下丘腦中TGF-β1的表達(dá)Tab.7 Expression of TGF-β1 in hypothalamusin of each group in different

注:棕色為TGF-β1表達(dá)陽性。圖1 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)下丘腦組織中TGF-β1表達(dá)(HE,×400)Fig.1 Expression of TGF-β1 in hypothalamusin of each group in different periods(HE,×400)

2.5.2垂體中TGF-β1的表達(dá) 染氟4、5個(gè)月時(shí),各染氟組大鼠垂體組織TGF-β1表達(dá)水平比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與對(duì)照組比較,各染氟組大鼠染氟4個(gè)月時(shí),垂體組織TGF-β1表達(dá)水平均低于對(duì)照組(P<0.05),而在第5個(gè)月,中、高氟組大鼠垂體組織TGF-β1表達(dá)水平低于對(duì)照組和低氟組(P<0.05)。見表8、圖2。

表8 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)垂體中TGF-β1表達(dá)Tab.8 Expression of TGF-β1 in pituitary of each group in different periods

注:棕色為TGF-β1表達(dá)陽性。圖2 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)垂體組織中TGF-β1表達(dá)(HE,×400)Fig.2 Expression of TGF-β1 in pituitary of each group in different periods(HE,×400)

2.5.3卵巢中TGF-β1的表達(dá) 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)各染毒組卵巢組織中TGF-β1表達(dá)水平比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與對(duì)照組比較,除第4個(gè)月低氟組大鼠卵巢組織中TGF-β1表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)、其余各組染氟及染氟時(shí)間點(diǎn)大鼠卵巢組織中TGF-β1表達(dá)水平均低于對(duì)照組,且低、中氟組隨染氟時(shí)間延長而降低(P<0.05)。見表9、圖3。

3 討論

本研究結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,不同氟劑量組均出現(xiàn)了不同程度的氟斑牙,且檢出率隨染毒劑量而增加,這與相關(guān)報(bào)道氟斑牙是氟中毒早期最常見的癥狀結(jié)果一致[16-17];同時(shí),尿氟和骨氟作為機(jī)體代謝綜合作用結(jié)果,可反映近期氟的攝入量和體內(nèi)的蓄積情況[18],本實(shí)驗(yàn)中染毒組的尿氟、骨氟受劑量和時(shí)間影響,呈上升趨勢(shì),說明雌性大鼠通過食物染氟方式導(dǎo)致氟在體內(nèi)逐漸被代謝和蓄積結(jié)果。

表9 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)卵巢中TGF-β1的表達(dá)Tab.9 Expression of TGF-β1 in ovarian of each group in different

注:棕色為TGF-β1表達(dá)陽性。圖3 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)卵巢組織中TGF-β1表達(dá)(HE,×400)Fig.3 Expression of TGF-β1 in ovarian of each group in different periods(HE,×400)

在有關(guān)研究化學(xué)毒物對(duì)實(shí)質(zhì)臟器的影響中,臟器系數(shù)能夠反映化學(xué)毒物對(duì)臟器的影響 ,也是尋找毒物作用靶器官的重要線索[19];臟器系數(shù)下降有可能是該實(shí)質(zhì)器官發(fā)生萎縮、退行性改變;臟器系數(shù)升高 ,可考慮實(shí)質(zhì)器官有充血、水腫、增生及肥大等變化的可能性。在本研究中,各染毒組雌性大鼠下丘腦、垂體組織臟器系數(shù)于各染毒時(shí)間段差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但卵巢臟器系數(shù)于染毒第4個(gè)月、第5個(gè)月差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且中氟組、高氟組卵巢組織臟器系數(shù)高于對(duì)照組(P<0.05);這表明氟中毒可能對(duì)下丘腦、垂體臟器系數(shù)未產(chǎn)生明顯的影響,這與有關(guān)研究探索氟中毒對(duì)生殖系統(tǒng)影響結(jié)果相似[20-21];以上研究結(jié)果可能與所攝入氟通過血腦屏障含量有關(guān),而且以往研究已經(jīng)證實(shí)氟主要的蓄積部位是骨骼[22-23],因此氟可能進(jìn)入其他靶器官的含量相比骨骼較少;并且已有研究表明,機(jī)體過多氟可通過血腦屏障蓄積在腦組織,從而誘發(fā)脂質(zhì)過氧化導(dǎo)致腦細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞[24]。因此出現(xiàn)以上結(jié)果有可能與血腦屏障特異性主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān),并且腦脊液的引流排泄作用也有可能將腦內(nèi)多余的氟排出,從而維持腦內(nèi)動(dòng)態(tài)平衡[25]。故本研究中氟到達(dá)腦組織的量不會(huì)隨氟攝入量而增加,少量蓄積在腦內(nèi)的氟對(duì)腦組織主要作用部位可能是大腦皮層,對(duì)接近間腦位置的下丘腦和位于垂體窩的垂體僅產(chǎn)生輕度的毒性作用,還不足以導(dǎo)致下丘腦、垂體出現(xiàn)顯的病理學(xué)改變;以上與周勇江[21]通過大鼠氟化鈉飲水方式染毒結(jié)果相似,說明慢性氟中毒主要影響雌性大鼠的卵巢組織,而對(duì)下丘腦和垂體組織影響不明顯。

TGF-β家族成員包括TGF-β1至TGF-β6,但在哺乳動(dòng)物中僅發(fā)現(xiàn)TGF-β1至TGF-β3,其中,以TGF-β1的活性最強(qiáng),數(shù)量最多,幾乎存在于所有細(xì)胞中。有關(guān)氟中毒非骨相研究中,韓學(xué)衛(wèi)[26]發(fā)現(xiàn)氟作用下大鼠腎臟TGF-β1 表達(dá)顯著升高,TGF-β1可作為氟作用下腎臟損害主要檢測(cè)指標(biāo)之一。在本研究中,不同染毒組下丘腦組織TGF-β1表達(dá)水平僅于第5個(gè)月差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),并隨染毒劑量而增加,說明氟在持續(xù)染毒情況下才可刺激下丘腦組織中TGF-β1表達(dá)增強(qiáng),以上與韓學(xué)衛(wèi)得到結(jié)果相似。但在雌鼠垂體中TGF-β1表達(dá)中,我們觀察到染毒第4個(gè)月、第5個(gè)月,中氟組、高氟組雌鼠垂體中TGF-β1表達(dá)隨染毒時(shí)間呈低表達(dá)水平,且較對(duì)照組下降幅度大,在有關(guān)氟中毒研究結(jié)果提示對(duì)照組中出現(xiàn)了研究部位TGF-β1微表達(dá)[26],說明長時(shí)間氟暴露情況下氟對(duì)垂體組織中小分子活性物質(zhì)表達(dá)的影響程度較正常情況下大。同時(shí),有研究認(rèn)為[27]TGF-β1能夠在卵巢組織中高度表達(dá),參與卵泡發(fā)育、顆粒細(xì)胞的增殖、分化和排卵過程,本研究也觀察到TGF-β1在雌鼠卵巢中表達(dá),但受氟劑量的影響呈低表達(dá)水平;有關(guān)研究提到:許多細(xì)胞因子既可影響下丘腦-垂體-卵巢軸激素的分泌,同時(shí)這些細(xì)胞因子的產(chǎn)生又可被這些激素調(diào)節(jié)[28];本研究中出現(xiàn)氟作用下雌鼠下丘腦、垂體、卵巢臟器中TGF-β1表達(dá)趨勢(shì)不同,這有可能與下丘腦-垂體-卵巢性腺軸雙向調(diào)節(jié)功能有關(guān)。同時(shí),本研究中未觀察到下丘腦-垂體組織臟器系數(shù)有明顯影響,但出現(xiàn)了下丘腦-垂體TGF-β1表達(dá)異常,有可能是氟導(dǎo)致該部位組織中小分子活性因子出現(xiàn)異常,但尚未引起該部位組織形態(tài)及生理功能出現(xiàn)明顯變化。因此,本研究提示,氟作用于雌性大鼠后可影響下丘腦-垂體-卵巢性腺TGF-β1表達(dá)水平,且主要作用部位是卵巢組織。