都元洪,甘平*

(貴州醫(yī)科大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)院,貴州 貴陽 550004)

腹膜透析(peritoneal dialysis,PD)是慢性腎病有效的替代療法,但可導(dǎo)致腹膜間皮細(xì)胞層丟失、腹膜下間皮層增厚和血管生成[1],引起腹膜纖維化(peritoneal fibrosis,PF)而使其應(yīng)用受到限制[2]。研究表明,在PD治療過程中高滲葡萄糖透析液不僅對間皮細(xì)胞有毒性作用,而且還能促進(jìn)免疫細(xì)胞凋亡[3]。轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)作為一種重要的纖維化因子,在腹膜間皮細(xì)胞暴露于高濃度葡萄糖的透析液中被誘導(dǎo)[4],TGF-β1/Smad3信號通路在肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中有重要作用[5]。α-硫辛酸(alpha-lipoic acid,α-LA)是一種天然的抗氧化劑,能夠調(diào)節(jié)線粒體活性、能量代謝和細(xì)胞生長,已被應(yīng)用于糖尿病多發(fā)外周神經(jīng)病變、肝硬化、心臟纖維化和系統(tǒng)性硬化的治療[6]。此外,α-LA可通過抑制肺上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化減輕SiO2誘導(dǎo)的肺纖維化[7]。然而,α-LA是否能在腹膜纖維化中調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)仍有待研究。因此,本研究探討α-LA對高糖腹膜透析液誘導(dǎo)的PF大鼠的作用及可能機(jī)制,現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 健康雄性SD大鼠30只,SPF級,體質(zhì)量(160±20) g,由貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供[許可證號SCXK(黔)2018-0001],大鼠飼養(yǎng)于(22～25) ℃、濕度(50±5)%的SPF層流罩中。

1.1.2主要試劑及儀器 α-LA注射液購自德國史達(dá)德大藥廠,4.25%葡萄糖腹膜透析液(PD solution,PDS)購自美國Baxter醫(yī)療,α-SMA、Collagen Ⅰ一抗購自英國Abcam,TGF-β1兔克隆抗體、p-Smad3兔克隆抗體購自美國Abclonal,p-Smad2兔克隆抗體(AF3450)、生物素化山羊抗兔IgG(H+L)購自美國Affinity,Western細(xì)胞裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物公司;AU5800全自動生化分析儀購自貝克曼庫爾特(蘇州),BA210Digital型數(shù)碼三目攝像顯微鏡購自麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司,JY200C型電泳儀購自北京君意東方電泳設(shè)備有限公司,TE22型蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜儀購自美國 Hoefer公司,5200型化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀購自上海天能科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1分組與建模 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,隨機(jī)分為空白對照組(A組)、模型組(B組)、α-LA腹腔注射高劑量組(400 μmol/L,C組)、α-LA腹腔注射中劑量組(300 μmol/L,D組)、α-LA腹腔注射低劑量組(200 μmol/L,E組)、α-LA灌胃組(300 μmol/L,F組),每組5只。A組腹腔注射生理鹽水20 mL,B、C、D、E、F組腹腔注射4.25% PDS 20 mL(輕揉按摩),1次/d,連續(xù)4周;C、D、E組在造模同時經(jīng)腹腔注射相應(yīng)劑量α-LA、1次/d,F組在造模同時灌胃α-LA(300 μmol/L,1次/d),A、B組腹腔注射等量生理鹽水,連續(xù)4周[8],記錄處理前后大鼠體質(zhì)量。

1.2.2腹膜組織取樣 各組大鼠末次干預(yù)后,腹腔注射4.25%PDS(輕揉按摩)2 h;之后,腹腔注射1%戊巴比妥鈉(35 mg/kg)、頸椎脫臼處死、開腹(注意避開左下腹注射部位),取大鼠右下腹近白線處壁腹膜組織5 mm×4 mm×3 mm各3份,1份保存于-20 ℃冰箱內(nèi),1份保存于液氮中,1份固定于4%多聚甲醛。

1.2.3HE、Masson's染色觀察腹膜組織形態(tài) 取腹膜組織用4%甲醛固定、石蠟包埋、切片,HE和Masson's染色,二甲苯脫蠟透明,中性樹膠封固,HE染色切片、顯微鏡下觀察組織病變,Masson's染色切片、顯微鏡下觀察膠原纖維情況,并采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件對膠原纖維面積進(jìn)行半定量分析,纖維組織表達(dá)面積(%)=藍(lán)色膠原纖維的面積/(視野總面積-空腔面積)×100% 。

1.2.4檢測α-SMA、Collagen Ⅰ蛋白表達(dá) 取腹膜組織固定、石蠟包埋和切片,3%H2O2中孵育30 min,山羊血清封閉,置于一抗α-SMA(1∶200)、Collagen Ⅰ(1∶100)中4 ℃孵育,洗滌后在室溫下與二抗孵育1 h,蘇木素染色,鏡檢觀察,并采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)計(jì)算 α-SMA、Collagen Ⅰ的平均光密度值(IOD),IOD=腹膜組織陽性細(xì)胞光密度總和/陽性面積。

1.2.5檢測 TGF-β1、p-Smad 2及p-Smad 3蛋白表達(dá) 取大鼠腹膜組織加入含有蛋白酶抑制劑的裂解液RIPA裂解,14 000 r/min于4 ℃離心10 min后收集上清液,BCA法測蛋白質(zhì)濃度;蛋白樣品用SDS-PAGE分離,轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上,用5%脫脂牛奶溶液室溫下封閉1 h,然后置于一抗TGF-β1(1∶2 000)、p-Smad 2(1∶2 000)、p-Smad 3(1∶2 000)和β-actin(1∶100 000)中 4 ℃孵育過夜,之后用山羊抗兔二抗(1∶20 000)孵育1 h、TBST清洗,使用凝膠成像分析儀和天能GIS軟件V2.0對條帶進(jìn)行曝光掃描,以β-actin為內(nèi)參,目的蛋白相對表達(dá)量=目的蛋白積分光密度值(IOD目的)/內(nèi)參積分光密度值(IOD內(nèi)參)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠體質(zhì)量

處理前各組大鼠體質(zhì)量組間比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),活動均未見異常;處理后C組大鼠體質(zhì)量較A、B、F組低(P<0.05)。見表1。

2.2 大鼠腹膜組織學(xué)改變

A組大鼠腹膜組織結(jié)構(gòu)較為完整、清晰,未見明顯增厚;B組大鼠腹膜組織明顯增厚,表面單層上皮細(xì)胞排列紊亂,由扁平狀變?yōu)閳A形或柱狀,部分區(qū)域間皮缺失,間皮下大量纖維組織增生、伴少量炎性細(xì)胞浸潤,新生毛細(xì)血管數(shù)量明顯增多,局部區(qū)域出血;C組大鼠腹膜組織結(jié)構(gòu)較為完整,未見明顯增厚,表面被覆單層扁平上皮,排列較為整齊,間皮下少量纖維組織增生伴極少量炎性細(xì)胞浸潤;D組大鼠腹膜組織輕微增厚,表面間皮由扁平上皮變?yōu)閳A形,間皮下少量纖維增生,見少量成纖維細(xì)胞,胞質(zhì)染色較為均勻;E組大鼠腹膜組織增厚,表面單層上皮細(xì)胞排列紊亂,由扁平狀變?yōu)閳A形或柱狀,間皮下纖維組織增生,見少量成纖維細(xì)胞;F組大鼠腹膜組織增厚,表面間皮細(xì)胞由扁平狀變?yōu)閳A形或柱狀,間皮下纖維組織增生,見少量成纖維細(xì)胞聚集。見圖1。

表1 處理前后各組大鼠體質(zhì)量Tab.1 Body mass index of rats in each group

2.3 大鼠腹膜組織纖維化

Masson's結(jié)果顯示,與A組比較,B組腹膜組織內(nèi)纖維化表達(dá)面積百分比升高(P<0.05);與B組相比,C、D、E組腹膜組織內(nèi)纖維化表達(dá)面積百分比降低(P<0.05);與F組比較,C、D、E組腹膜組織內(nèi)纖維化表達(dá)面積百分比降低(P<0.05)。見表2、圖2。

表2 各組大鼠腹膜纖維組織表達(dá)面積百分比Tab.2 Percentage of peritoneal fibrous tissue expression area in each

注:黑色箭頭表示腹膜增厚;綠色箭頭表示纖維組織增生;藍(lán)色箭頭表示出血。圖1 各組大鼠腹膜組織形態(tài)(HE)Fig.1 Peritoneal histomorphology of rats in each group (HE)

注:黑色箭頭表示纖維化表達(dá)。圖2 各組大鼠腹膜組織纖維化(Masson染色,×200)Fig.2 Peritoneal tissue fibrosis in all groups (Masson stainig,×200)

2.4 大鼠腹膜組織α-SMA、CollagenⅠ蛋白表達(dá)

免疫組化染色檢測結(jié)果顯示,與A組比較,B組腹膜組織α-SMA、Collagen Ⅰ表達(dá)升高(P<0.05);與B組相比,C、D、E、F組腹膜組織α-SMA表達(dá)降低(P<0.05),C、D組腹膜組織Collagen Ⅰ表達(dá)降低(P<0.05);與F組比較,C、D組腹膜組織α-SMA、Collagen Ⅰ表達(dá)降低(P<0.05)。見圖3、表3。

注:圖中黑色箭頭表示呈黃色或棕黃色的陽性細(xì)胞。圖3 各組大鼠腹膜組織α-SMA及CollagenⅠ蛋白表達(dá)(免疫組化染色,×20)Fig.3 Expressions of α-SMA and CollagenⅠprotein in peritoneal tissues of rats in each group (immunohistochemical staining,×20)

表3 各組大鼠腹膜組織α-SMA及CollagenⅠ的相對表達(dá)Tab.3 Relative expressions of α-SMA and CollagenⅠ in peritoneal tissues of each

2.5 大鼠腹膜組織TGF-β1/Smads信號通路變化

與A組比較,B組腹膜組織TGF-β1、p-Smad 2、p-Smad 3蛋白表達(dá)升高(P<0.05);與B組相比,C、D、E、F組腹膜組織TGF-β1蛋白表達(dá)降低(P<0.05),C、D、F組腹膜組織p-Smad 2蛋白表達(dá)降低(P<0.05),C、D組腹膜組織p-Smad 3蛋白表達(dá)降低(P<0.05);與F組比較,C、D組腹膜組織TGF-β1、p-Smad 2蛋白表達(dá)降低(P<0.05),C組p-Smad 3蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。見圖4。

注:A為Western blot檢測TGF-β1、p-Smad 2、p-Smad 3蛋白免疫印跡條帶,B為TGF-β1、p-Smad 2、p-Smad 3蛋白表達(dá);(1)與A組相比,P<0.05;(2)與B組相比,P<0.05;(3)與F組相比,P<0.05。圖4 各組大鼠腹膜組織TGF-β1、p-Smad 2及p-Smad 3蛋白表達(dá)Fig.4 Expressions of TGF-β1,p-Smad 2,and p-Smad 3 protein of peritoneal tissues in each group

3 討論

在終末期腎臟病接受PD治療的患者中,PF的發(fā)生率和程度隨著透析時間的延長而增加,是導(dǎo)致患者退出PD治療、PD技術(shù)存活率降低和患者死亡率升高的主要危險(xiǎn)因素[10]。目前臨床大規(guī)模使用的高濃度PDS,在與腹膜間皮細(xì)胞的長期接觸過程中,因其生物相容性不佳,導(dǎo)致間皮細(xì)胞產(chǎn)生活性氧、分泌炎癥因子,使腹膜局部組織細(xì)胞長期處于慢性炎癥狀態(tài),并誘發(fā)腹膜間皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition,EMT),啟動新生血管形成,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,最終引起腹膜組織纖維化,透析效能下降[11-12]。4.25%PDS腹腔注射誘導(dǎo)的大鼠PF能更接近終末期腎病接受腹膜透析患者的腹膜環(huán)境,近年來已成為研究PD所致纖維化的成熟造模方法[13]。在本研究中,造模大鼠的腹膜組織明顯增厚、細(xì)胞排列紊亂,此外還觀察到血管增生;α-LA腹腔高劑量注射干預(yù)后腹膜組織形態(tài)學(xué)表型改善,纖維化表達(dá)面積百分比小于α-LA灌胃組。Yung等[14]研究報(bào)道,高濃度的葡萄糖及其降解產(chǎn)物和晚期糖基化終末產(chǎn)物是EMT和PF的關(guān)鍵媒介;本研究結(jié)果顯示4.25%PDS導(dǎo)致了大鼠PF,α-SMA及Collagen Ⅰ表達(dá)量增加,與王乙安等[15]研究結(jié)果一致,支持這一結(jié)論。在α-LA腹腔注射(高、中)劑量組干預(yù)后,腹膜組織α-SMA及Collagen Ⅰ表達(dá)降低,表明α-LA腹腔注射可能抑制了透析液誘導(dǎo)的PF過程。

TGF-β1是TGF-β蛋白超家族中的一員,主要由巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和血小板產(chǎn)生,在體外可通過加熱、低pH、蛋白水解或脫糖作用從TGF-β1-LAP復(fù)合物中活化和解離,因此,低pH水平的PDS可能有助于腹膜TGF-β1的活化[16]。Heo等[17]研究表明,間皮細(xì)胞是腹膜腔內(nèi)產(chǎn)生TGF-β1的主要細(xì)胞,且在TGF-β1的刺激下發(fā)生巨噬細(xì)胞移植并促進(jìn)PF。有關(guān)研究表明TGF-β1及其下游調(diào)控信號與心肌纖維化和其他多個臟器纖維化疾病相關(guān)[18-20]。Akhmetshina等[21]研究顯示TGF-β1還可以通過激活Wnt信號介導(dǎo)纖維化。此外,抑制TGF-β1信號被證明可以抑制肺纖維化[22]。同樣,在PF過程中,TGF-β1/Smads信號通路的激活是導(dǎo)致PF的主要機(jī)制之一[23]。TGF-β1與其受體結(jié)合后以磷酸化受體調(diào)節(jié)Smad2、Smad3,然后磷酸化的Smad2、Smad3復(fù)合物易位到細(xì)胞核中調(diào)節(jié)EMT相關(guān)基因的表達(dá),下調(diào)E-鈣粘著蛋白表達(dá),上調(diào)波形蛋白和α-SMA的表達(dá),致細(xì)胞外基質(zhì)積累甚至PF,最終導(dǎo)致腹膜超濾衰竭[24-25]。本研究結(jié)果表明在PF大鼠模型中,TGF-β1/Smad3信號通路被激活,而高劑量α-LA腹腔注射可抑制腹膜組織TGF-β1/Smad3信號激活,抑制α-SMA及Collagen Ⅰ的表達(dá),這與Xiong等[26]研究結(jié)果一致。此外,本研究結(jié)果顯示α-LA腹腔注射較灌胃對大鼠PF和腹膜組織TGF-β1/Smad3信號抑制效果更好,這可能是由于腹腔注射藥物通過腹膜吸收面積大,藥物直接吸收入血并快速調(diào)動機(jī)體先天免疫系統(tǒng)進(jìn)而抑制TGF-β1/Smad3激活,減輕PF,而灌胃給藥影響藥物吸收的因素較多,從而在一定程度上影響藥效[27]。本研究中處理前各組大鼠體質(zhì)量組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),而處理后C組較A、B、F組大鼠體質(zhì)量低,可能是由于腹腔注射α-LA使大鼠食欲下降進(jìn)而體重減輕所致[28-29]。

綜上所述,腹腔注射α-LA可有效地減輕高糖透析液誘導(dǎo)的大鼠PF,并能減輕TGF-β1/Smads信號通路激活程度,具有預(yù)防或治療PF的作用。