韓蕭蕭,李晨馳,劉冉陽,唐爽,馮琳琳,韓冰,謝汝佳,楊勤,***

(1.貴州醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學院 病理生理學教研室,貴州 貴陽 550025;2.貴州省常見慢性疾病發(fā)病機制及藥物研究重點實驗室,貴州 貴陽 550025;3.貴州醫(yī)科大學 醫(yī)學檢驗學院 臨床微生物免疫教研室,貴州 貴陽 550025)

非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty live diseaser,NAFLD)是指在沒有大量飲酒的情況下、以廣泛的肝細胞內脂質顯著沉積與持續(xù)的肝臟酶異常為特征的一種臨床綜合征[1],歐美地區(qū)NAFLD的發(fā)病率在20%以上,我國NAFLD發(fā)病率約為15%[2-3]。Ⅲ型纖連蛋白組件包含蛋白(type Ⅲ domain-containing protein 5,Fndc5)是由2個纖維蛋白結構域、1個信號肽和1個嵌入細胞膜的C末端疏水結構域構成,其在細胞膜上水解為鳶尾素(irisin)[4]。irisin作為一種新發(fā)現(xiàn)的可分泌性代謝調控因子[5],主要在骨骼肌和脂肪組織中表達,少量表達于腎臟、肝臟、胰腺及肺中[6-7]。irisin是促進白色脂肪轉變?yōu)樽厣镜闹匾{節(jié)因子,具有調節(jié)細胞脂肪氧化的能力和抑制白色脂肪沉積的作用,還可抑制肝臟糖異生[8]。研究認為,采用腺苷5′-氨酸磷酸活化蛋白激酶(adenosine 5′-momophosphate-activated protein kinase,AMPK)激動劑干預敲除Fndc5基因小鼠,發(fā)現(xiàn)缺失Fndc5基因小鼠的肝臟脂肪酸氧化功能受損狀況得到改善、甘油三脂含量下降,而采用過氧化物酶體增值激活受體ɑ(PPARα)激動劑可上調Fndc5基因缺失小鼠肝臟PPARα靶基因的表達,體外實驗亦證實此激動劑抑制棕櫚酸誘導的肝細胞脂質沉積[9]。齊墩果酸是一種被臨床用于治療急慢性肝炎的藥物,臨床應用過程中被發(fā)現(xiàn)具有不可避免的毒副作用,國內外學者開始研發(fā)齊墩果酸衍生物,到目前為止已有11種的齊墩果酸衍生物問世,DKS26是其中的一種。本實驗采用齊墩果酸衍生物DKS26作用于NAFLD模型小鼠,檢測小鼠肝臟Fndc5的表達,探究Fndc5是否可以作為NAFLD防治藥物的重要靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物 4～5周齡C57/BL小鼠40只,體質量18～20 g,購自貴州醫(yī)科大學實驗動物中心,動物使用許可證NO 2000059。

1.1.2主要試劑與儀器 齊墩果酸衍生物DKS26(純度99%,結構式見圖1)由貴州醫(yī)科大學藥學院提供,四氯化碳(純度99%,100 mL)購自羅恩試劑公司,鹽酸二甲雙胍(melbine,MET,純度98%,5 g)購自北京索萊寶生物有限公司,丙氨酸氨基轉移酶 (ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)和甘油三脂(TG)試劑盒均購自南京建成生物有限公司,Fndc5Ⅰ抗購自Novus Biologicals Europe公司,兔抗β-肌動蛋白(β-actin)購自ABclone公司,油紅(Oil red)購自美國Sigma公司。垂直電泳儀購于北京六一生物有限公司,凝膠成像系統(tǒng)購于BIO-BAD公司,全波長酶標儀與高速冷凍離心機購于Thermo公司,冰凍切片機與石蠟切片機購于Leica Biosystems公司。

圖1 齊墩果酸衍生物DKS26結構式Fig.1 Chemical structure of oleanolic acid derivative DKS26

1.2 研究方法

1.2.1高脂飲食配方及DKS26配制 普通飼料添加10%豬油、2%膽固醇、0.2%丙基硫氧嘧啶、0.5%膽酸鈉。DKS26配制:稱取DKS26粉末500 mg溶于羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液1 L中,配置成濃度為0.5 g/L的混合溶液。鹽酸MET配制:稱取鹽酸MET粉末500 mg溶于 CMC-Na溶液1 L中,配置成濃度為0.5 g/L的混合溶液。

1.2.2分組與建模 將40只C57/BL小鼠采用隨機雙盲法分為對照組(CON組)、模型組(MOD組)、MET組與DKS26組,每組10只。按參考文獻[10-12]用40%四氯化碳皮下注射加高脂飲食喂養(yǎng)方法建立脂肪肝模型,除CON組外,其余3組小鼠高脂飲食喂養(yǎng),皮下注射40%四氯化碳植物油、1次/3 d、共4次;共8周建立小鼠NAFLD模型。成模后,正常飲食喂養(yǎng),MET組和DKS26組小鼠分別給予100 mg/(kg·d)的MET和DKS26灌胃,CON組和MOD組小鼠給予100mg/(kg·d)的CMC-Na灌胃,1次/d,共6周。

1.2.3血清ALT、AST及肝臟TG含量 末次干預后,小鼠禁食禁水12 h,眼球取血1～1.5 mL,室溫下靜置15 min,以3 000 r/min離心8 min,取血清,采用試劑盒檢測小鼠血清ALT、AST;取各小鼠右葉相同部位的肝組織,行TG含量檢測。

1.2.4肝組織學觀察 末次干預后,小鼠麻醉后處死,無菌條件下剖腹取肝臟,采集各小鼠肝右葉相同部位4%多聚甲醛固定、石蠟包埋、切片、HE染色;另取肝右葉新鮮組織制作冰凍切片,進行油紅O染色后在鏡下觀察。

1.2.5肝組織Fndc5蛋白表達 取小鼠肝組織,加細胞裂解液制備組織勻漿,提取總蛋白、BCA法定量。12%SDA-PEGA蛋白凝膠分離,轉膜,脫脂牛奶封閉,加入兔Ⅰ抗[β-actin(1∶5 000)、Fndc5(1∶1 000)]置4 ℃孵育過夜。次日用TBST洗膜后加入羊抗兔Ⅱ抗(1∶5 000)室溫孵育1 h,TBST洗膜,ECL曝光顯示特異性條帶。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 小鼠肝臟中Fndc5蛋白表達

如圖2所示,與CON組比較,MOD組Fndc5小鼠肝臟蛋白表達下調(P<0.05),與MOD組比較,MET組與DKS26組小鼠肝臟蛋白表達上調(P<0.05),且DKS26組的Fndc5小鼠肝臟蛋白表達較MET組上調更為明顯(P<0.05)。

注:A為Fndc5蛋白條帶結果;B為Fndc5蛋白相對表達量結果;(1)與CON組比較,P<0.05;(2)與MOD組比較P<0.05;(3)與MET組比較,P<0.05。圖2 小鼠肝臟中Fndc5蛋白表達水平(Western blot)Fig.2 Expression level of Fndc5 protein in mice livers (Western blot)

2.2 小鼠肝臟外觀

CON組小鼠肝臟呈現(xiàn)紅色,無脂肪變性;MOD組小鼠肝臟相較于CON組體積變大,顏色變黃、質地變硬,肝臟表面黏膩不光滑,呈現(xiàn)脂肪變性;MET組與DKS26組小鼠肝臟與MOD組相比,體積變小、顏色變紅、表面光滑、無明顯脂肪變性。見圖3。

圖3 各組小鼠肝臟外觀Fig.3 Liver appearance of mice in each group

2.3 小鼠肝組織學變化

HE染色顯示MOD組小鼠肝細胞腫脹,胞核移至細胞邊緣,部分肝細胞內出現(xiàn)空泡變性及少量炎癥細胞;MET組和DKS26組肝小葉結構及肝細胞形態(tài)趨于正常,肝細胞輕微腫脹,空泡變性幾乎不可見,炎性細胞減少。見圖4。

注:紅色箭頭指示空泡變性。圖4 各組小鼠肝細胞結構(HE,×100)Fig.4 Liver cells structure of mice in each group (HE,×100)

2.4 小鼠肝細胞脂質沉積

MOD組肝細胞胞質中出現(xiàn)較多大小不一的橘紅色脂滴,MET組和DKS26組肝細胞胞質內橘紅色脂滴數(shù)量較MOD組明顯減少。見圖5。

注:紅色箭頭指示橘紅色脂滴。圖5 各組小鼠肝細胞脂質沉積(油紅O染色,×200)Fig.5 Lipid deposition in liver cells of mice in each group (oil red O staining,×200)

2.5 血清ALT、AST水平及肝臟TG含量

MOD組小鼠血清ALT、AST值明顯高于CON組(P<0.01),MET組和DKS26組ALT、AST值明顯低于MOD組(P<0.01),且DKS26組AST值明顯低于MET組(P<0.01);MOD組小鼠肝組織TG含量較CON組明顯增加(P<0.01),MET組和DKS26組小鼠肝組織TG含量較MOD組明顯下降(P<0.01),但MET組和DKS26組小鼠肝組織TG含量相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組小鼠血清ALT、AST水平及肝組織TG含量Tab.1 Serum ALT,AST levels and liver tissue TG content in each group of

3 討論

齊墩果酸是我國科研人員首次從青葉膽植物中提取出的一種五環(huán)三萜類化合物,之后發(fā)現(xiàn)多種植物與水果中均有齊墩果酸的存在,并已有多項研究證實其具有保肝降脂的作用,可用于NAFLD的治療[13-16]。但有研究發(fā)現(xiàn),齊墩果酸具有生物利用度低及高劑量會導致肝損傷的缺點[17-18]。因此眾多學者為規(guī)避其缺點,研發(fā)了11種齊墩果酸衍生物[19]。DKS26是貴州醫(yī)科大學藥學院人工合成的一種齊墩果酸衍生物,具有保肝、降糖、抗炎及降脂等作用[20],但是具體降脂的作用機制尚不清楚。本實驗通過采用40%四氯化碳橄欖油混合溶液皮下注射加高脂飲食方法建立小鼠NAFLD模型,觀察DKS26干預后小鼠脂肪肝的改善情況。

Fndc5的水解產物irisin是一種由小鼠和人類運動誘導的肌肉因子/脂肪因子,它被認為誘導白色脂肪組織棕色化,其主要目的是增加產熱和能量消耗。irisin自從被發(fā)現(xiàn)以來,就用于多種代謝性疾病的治療,如肥胖癥、2型糖尿病、脂質代謝性和心血管疾病、非酒精性脂肪肝疾病、多囊卵巢綜合征和代謝型骨骼疾病等[21]。但它是否作為治療NAFLD的藥物靶點目前尚不明確。有研究表明,irisin具有調節(jié)細胞脂肪酸氧化能力和抑制白色脂肪組織沉積的作用[8]。PPARα是調控脂質代謝和脂肪酸氧化的關鍵轉錄因子[22],同時也是Fndc5/irisin的下游靶點。AMPK可以上調PPARα基因從而促進脂肪酸氧化。Tateya等[23]發(fā)現(xiàn),敲除Fndc5基因小鼠肝臟正常喂養(yǎng)和禁食誘導的脂肪酸有關基因表達和AMPK活性明顯降低,然而AICAR(AMPK激動劑)可改善Fndc5基因缺失造成的肝臟脂肪酸氧化功能受損,并且可降低肝臟TG含量。Liu等[9]也發(fā)現(xiàn),WY14643(PPARα激動劑)可以上調敲除Fndc5基因小鼠肝臟PPARα靶基因的表達,并且體外實驗也表明,此激動劑也可以降低棕櫚酸誘導的肝細胞脂質沉積[9]。以上皆提示Fndc5對脂肪酸氧化的起著重要的調控作用。因此本實驗采用Western blot法檢測各組小鼠肝組織Fndc5蛋白的表達,結果顯示,MOD組小鼠肝組織Fndc5蛋白表達明顯少于CON組,MET組與DKS26組小鼠肝組織Fndc5蛋白表達較MOD組上調,提示DKS26與MET可能通過調控Fndc5的蛋白表達來改善小鼠NAFLD。

各組小鼠取肝臟外觀上:MOD組小鼠肝臟顏色變黃、體積變大、脂肪變性,而CON組肝臟顏色為紅色、表面光滑、無脂肪變性,與MOD相比,MET組和DKS26組小鼠肝臟顏色變紅、體積變小。HE染色結果顯示CON組小鼠肝細胞結構正常、肝小葉排列整齊,MOD組小鼠肝細胞表現(xiàn)為空泡樣變性、匯管區(qū)炎性細胞浸潤、肝小葉結構紊亂,MET組與DKS26組相比于MOD組肝細胞空泡變性減輕、匯管區(qū)炎性細胞浸潤減輕、肝小葉結構接近正常。油紅O染色結果顯示CON組小鼠肝細胞未見明顯脂質沉積,MOD組小鼠肝細胞內可見明顯紅色脂滴顆粒,相較于MOD組,MET組和DKS26組小鼠肝細胞內紅色脂滴數(shù)目減少。小鼠肝組織TG含量結果提示:MOD與CON組相比明顯上升,MET組與DKS26組小鼠相較于MOD組小鼠明顯下降。而且,MET組與DKS26組干預處理后小鼠血清ALT、AST水平相較于MOD組明顯減少。以上結果均提示DKS26治療之后NAFLD小鼠的肝組織學形態(tài)、功能指標及肝脂肪沉積均有所改善。

綜上所述,齊墩果酸衍生物DKS26具有護肝作用,其機制之一可能是通過irisin前體Fndc5這一靶點來調控脂質氧化分解的。