蘭 英，李韶峰，2，陳必鏈，2，何勇錦，2

(1.福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350117；2.福建師范大學(xué)工業(yè)微生物教育部工程研究中心，福建 福州 350117)

微藻被認(rèn)為是能進(jìn)行光合作用的單細(xì)胞生物，其在淡水和海洋水生環(huán)境中都能生長(zhǎng)，不與糧食作物競(jìng)爭(zhēng)耕地[1].微藻富含蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、多糖、維生素等多種生物活性物質(zhì)，被廣泛應(yīng)用于食品、飼料、保健品、生物燃料等領(lǐng)域[2].中國(guó)衛(wèi)健委(2016年)、歐盟新食品管理局、美國(guó)食品監(jiān)督管理局等機(jī)構(gòu)已批準(zhǔn)微擬球藻、小球藻、螺旋藻、雨生紅球藻、杜氏鹽藻等藻種為新資源食品[3].在眾多的海洋微藻中，微擬球藻(Nannochloropsissp.)具有生長(zhǎng)速率快、油脂合成能力強(qiáng)、二十碳五烯酸(EPA)含量高等特點(diǎn)，受到微藻科技工作者的關(guān)注.眾所周知，微擬球藻可用于生產(chǎn)可再生和可持續(xù)的生物柴油，在脂肪酶TL乙醇醇解催化下，微擬球藻(NannochloropsisoculataZ-1)生物柴油轉(zhuǎn)化率高達(dá)90.24%[4].已有大量研究表明，EPA可預(yù)防或降低某些疾病的風(fēng)險(xiǎn)，如心血管疾病、癌癥、炎癥和精神疾病等[5-6].因此，微擬球藻是一種潛在開(kāi)發(fā)EPA的海洋微藻.

前期的研究表明，微擬球藻合成的EPA主要分布在磷脂上.例如，Sánchez等[7]研究發(fā)現(xiàn)，微擬球藻合成的中性脂和磷脂的EPA含量分別為9.8%和24.2%.Mitra等[8]也發(fā)現(xiàn)，微擬球藻磷脂的EPA含量高于其所合成中性脂和糖脂的EPA含量.因此，本研究擬利用微擬球藻磷脂開(kāi)發(fā)EPA.

目前，市售的EPA主要是乙酯型EPA.因此，亟需研發(fā)一種可將微擬球藻磷脂EPA轉(zhuǎn)化為乙酯型EPA的綠色經(jīng)濟(jì)的方法.化學(xué)法和脂肪酶法是當(dāng)前制備乙酯型EPA的常見(jiàn)方法.化學(xué)法制備乙酯型EPA往往需要酸堿試劑、高溫、長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間等條件，會(huì)氧化EPA，影響目的產(chǎn)物的品質(zhì)[9].與化學(xué)法不同的是，脂肪酶催化制備乙酯型EPA是將含有EPA底物在脂肪酶的作用下發(fā)生乙醇醇解反應(yīng)獲得乙酯型EPA，具有反應(yīng)條件溫和、催化效率高等特點(diǎn)，受到科研工作者和油脂企業(yè)家的關(guān)注，被認(rèn)為是最為潛力用于制備乙酯型EPA的方法[10].本課題組使用脂肪酶CALA通過(guò)一步酶解反應(yīng)將n-3多不飽和脂肪酸從三酰甘油中的25%～27%濃縮到單酰甘油中的88%～92%[11].此外，利用脂肪酶CALA乙醇醇解催化酶解破壁的微擬球藻，藻油的EPA含量可達(dá)到60.81%[12].因此，利用脂肪酶醇解催化微擬球藻磷脂EPA，可生產(chǎn)制備高附加值EPA.

目前，商用脂肪酶常見(jiàn)的形態(tài)有固定化和液體形式.固定化脂肪酶用于催化油脂具有易于回收、較好的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)，成為改性油脂領(lǐng)域的重要生物催化劑.為此，本研究工作以富含EPA的微擬球藻磷脂為底物，選擇Lipozyme RM IM、Lipozyme TL IM和Novozym 435脂肪酶為生物催化劑，篩選最適合乙醇醇解催化微擬球藻磷脂EPA的脂肪酶；隨后，以最適合的固定化脂肪酶為研究對(duì)象，優(yōu)化其乙醇醇解催化微擬球藻磷脂EPA生產(chǎn)制備乙酯型EPA的工藝條件(見(jiàn)圖1)，旨在為高值化開(kāi)發(fā)海洋微藻油脂提供實(shí)踐依據(jù).

圖1 微擬球藻磷脂制備乙酯EPAFig.1 Nannochloropsis phospholipids to prepare ethyl-EPA

1 材料與方法

1.1 藻種來(lái)源

微擬球藻粉(Nannochloropsissp.)，購(gòu)于山東餌料微藻公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

氫氧化鉀、甲醇、磷酸二氫鈉一水合物、磷酸氫二鈉七水合物均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硫酸銨、無(wú)水乙醇、正己烷、異丙醇均為分析純，購(gòu)于西隴科學(xué)股份有限公司；纖維素酶(酶活：100 000 U·g-1)購(gòu)自南寧鵬博生物工程有限公司；固定化Novozym 435、Lipzoyme TL IM和Lipzoyme RM IM 由丹麥諾維信公司提供.

0.5 mol·L-1KOH-CH3OH溶液：使用電子天平稱量28.05 g氫氧化鉀溶于少量甲醇中，然后將溶液倒入1 L的容量瓶中，用甲醇定容到1 L.

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

臺(tái)式高速離心機(jī)-TG16-WS(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開(kāi)發(fā)有限公司)；氣相色譜儀-Scion 436(廣州多譜科學(xué)儀器有限公司)；數(shù)顯恒溫水浴鍋-HH-4(國(guó)華電器有限公司)；智能磁力攪拌器-ZNCL-BS(鞏義市科華儀器設(shè)備有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器-RE52CS-1(上海亞榮生化儀器廠)；電子分析天平-BASA124S(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；微型旋渦混合儀-WH-3(上海滬西分析儀器廠有限公司)；循環(huán)水式多用真空泵-SHB-Ⅲ(上海予捷儀器有限公司)等.

1.4 微擬球藻磷脂的提取

取1 kg微擬球藻藻粉，加入5 L濃度為0.2 mol·L-1的磷酸緩沖液(pH=5)和0.01 kg纖維素酶，置于恒溫水浴搖床(50 ℃)中酶解2 h，加入硫酸銨(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%)，隨后加入與懸浮液同體積的叔丁醇，充分混勻后，于恒溫水浴搖床(80 ℃)反應(yīng)1 h后取出轉(zhuǎn)移至分液漏斗中靜置[13].取出上層液，在8 000 r·min-1、4 ℃條件下離心，收集上清液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除有機(jī)溶劑后，得到微擬球藻粗油.

取0.4 kg微擬球藻粗油，加入3.2 L正己烷-異丙醇混合液(體積比3∶1)，充分混勻后在溫度40 ℃的水浴搖床充分振蕩2 h，隨后將樣品進(jìn)行低速離心(4 000 r·min-1，5 min)，取異丙醇層，旋蒸去除有機(jī)溶劑獲得粗磷脂樣品；隨后，再用丙酮沖洗脫油脫水，重復(fù)3次，獲得微擬球藻磷脂.

1.5 脂肪酶催化醇解工藝參數(shù)優(yōu)化

稱取0.5 g的微擬球藻磷脂，加入4.5 g無(wú)水乙醇，溶解后加入酶載量為8%的3種固定化脂肪酶(脂肪酶Novozym 435、Lipozyme RM IM、Lipozyme TL IM)，在反應(yīng)溫度35 ℃條件下，酶催化8 h，篩選最適合醇解催化微擬球藻磷脂的脂肪酶.

以所篩選到最適合的脂肪酶為研究對(duì)象，選擇固定化形態(tài)的脂肪酶醇解催化微擬球藻磷脂，優(yōu)化醇油質(zhì)量比(1∶1、3∶1、5∶1、7∶1、9∶1、11∶1)、酶載量(1%、8%、15%、22%、29%)、反應(yīng)溫度(30、35、40、45、50、55 ℃)、含水量(0%、2%、5%、10%、15%、20%)、反應(yīng)時(shí)間(2、4、6、8、10、12、24 h)等催化工藝.

1.6 分析方法

在脂肪酶的作用下，磷脂與乙醇會(huì)發(fā)生醇解反應(yīng)，產(chǎn)生脂肪酸乙酯(FAEEs)，脂肪酸乙酯可直接用于氣相色譜儀分析.待反應(yīng)完成后，取大約1 mg的反應(yīng)產(chǎn)物，加入1 mL正己烷(含0.2 mg十七烷甲酯)充分溶解，進(jìn)行氣相色譜儀(SCION 436-GC，Bruker；色譜柱子，Omegawax?250毛細(xì)管，30 m × 0.32 mm × 0.25 μm)[14]，分析總脂肪酸乙酯含量.乙酯轉(zhuǎn)化率可按下列公式進(jìn)行計(jì)算：

1.7 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行3次，利用Microsoft Excel 2010和Origin 8.5軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，結(jié)果用平均值標(biāo)準(zhǔn)差表示.IBM SPSS22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析乙酯轉(zhuǎn)化率的顯著差異性(P<0.05).

2 結(jié)果與分析

2.1 微擬球藻磷脂的脂肪酸組成

本研究工作將利用纖維素酶進(jìn)行酶解微擬球藻藻粉，隨后用硫酸銨和叔丁醇介導(dǎo)的三相分離法提取微擬球藻粗油，用正己烷-異丙醇萃取所得微擬球藻粗磷脂，最后用丙酮萃取獲得微擬球藻磷脂.將所得微擬球藻磷脂進(jìn)行脂肪酸測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1.從表1可知，微擬球藻磷脂的主要脂肪酸是棕櫚酸(16.4%)、棕櫚油酸(17.0%)和EPA(51.9%).Matsui等[15]研究發(fā)現(xiàn)，微擬球藻(Nannochloropsisoculata)在缺氮和缺磷條件下所合成磷脂的EPA質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為15.3%和28.2%.Callejón等[16]分析微擬球藻(Nannochloropsisgaditana)中性脂、糖脂和磷脂的脂肪酸時(shí)的結(jié)果表明，該藻的磷脂EPA質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為22.0%.值得注意的是，本研究所得微擬球藻磷脂的EPA質(zhì)量分?jǐn)?shù)比前人所報(bào)道的結(jié)果更高.說(shuō)明本研究所使用的微擬球藻磷脂更適合開(kāi)發(fā)富含EPA制品.

表1 微擬球藻磷脂的脂肪酸組成和酶催化所得脂肪酸乙酯的脂肪酸組成Tab.1 Fatty acid composition of Nannochloropsis-derived phospholipids and FAEEs catalyzed by enzyme

2.2 篩選乙醇醇解催化微擬球藻磷脂的脂肪酶

在酶載量8%(基于磷脂量)、醇油m(無(wú)水乙醇)∶m(磷脂)=9∶0.1、反應(yīng)溫度35 ℃、反應(yīng)時(shí)間8 h、轉(zhuǎn)速500 r·min-1的條件下，考察不同脂肪酶對(duì)醇解催化微擬球藻磷脂的乙酯轉(zhuǎn)化率影響，結(jié)果如圖2所示.

圖2 不同脂肪酶對(duì)醇解催化微擬球藻磷脂的乙酯轉(zhuǎn)化率的影響Fig.2 Effect of different lipases on the FAEEs conversion rates byenzymatic ethanolysis of Nannochloropsis-derived phospholipid

由圖2可知，在所選擇的3種脂肪酶中，Novozym 435催化微擬球藻磷脂獲得最高的乙酯轉(zhuǎn)化率(52.07%)；Lipzome RM IM催化微擬球藻磷脂所得最低的乙酯轉(zhuǎn)化率(6.83%).不同脂肪酶催化微擬球藻磷脂表現(xiàn)出明顯差異的催化性能，這主要是因?yàn)椴煌瑏?lái)源的脂肪酶具有各自的氨基酸組成序列和酶空間結(jié)構(gòu)，賦予其不同的催化特性.因此，由圖2結(jié)果可得，最適合用于催化微擬球藻磷脂的生物催化劑為Novozym 435.

2.3 優(yōu)化Novozym 435催化微擬球藻磷脂生產(chǎn)制備乙酯型EPA的工藝條件

圖3A說(shuō)明了不同酶載量對(duì)Novozym 435催化微擬球藻磷脂性能的影響，由圖3A可知，當(dāng)固定化脂肪酶Novozym 435的酶載量從1%增加到15%時(shí)，Novozym 435催化微擬球藻磷脂的乙酯轉(zhuǎn)化率呈上升趨勢(shì)，即32.38%提高到76.08%.但是，當(dāng)酶載量繼續(xù)增加至22%或29%時(shí)，脂肪酶的乙酯轉(zhuǎn)化率則表現(xiàn)下降趨勢(shì)(如圖3A).這可能是因?yàn)殡S著酶載量的增加，底物的反應(yīng)位點(diǎn)達(dá)到飽和，過(guò)量的酶會(huì)增加反應(yīng)過(guò)程的傳質(zhì)阻力，導(dǎo)致乙酯轉(zhuǎn)化率降低.因此，基于圖3A的結(jié)果，最佳Novozym 435酶載量為15%.

有研究表明，適量的水分子可促進(jìn)脂肪酶催化油脂，表現(xiàn)出最佳的催化性能.圖3B的結(jié)果是關(guān)于不同含水量對(duì)Novozym 435催化微擬球藻磷脂性能的影響.從圖3B可清楚看出，當(dāng)反應(yīng)體系中的含水量從0%增加到2%，固定化脂肪酶Novozym 435催化微藻磷脂的乙酯轉(zhuǎn)化率呈現(xiàn)顯著上升趨勢(shì).但是，當(dāng)催化體系中的含水量超過(guò)2%，脂肪酶催化所得的乙酯轉(zhuǎn)化率隨含水量的增加而降低.這可能的原因是，過(guò)多的水分子會(huì)對(duì)脂肪酶中親水基團(tuán)發(fā)生非共價(jià)鍵、范德華力等作用，影響酶分子結(jié)構(gòu)和構(gòu)象，阻礙底物分子與脂肪酶催化中心的作用，導(dǎo)致酶催化性能的降低.因此，最適合Novozym 435催化微擬球藻磷脂的含水量為2%.

不同的醇油質(zhì)量比會(huì)影響脂肪酶催化微藻磷脂，其結(jié)果見(jiàn)圖3C.從圖3C可得，當(dāng)乙醇與微藻磷脂底物質(zhì)量比為1∶1時(shí)，Novozym 435催化磷脂所得的乙酯轉(zhuǎn)化率僅為45.35%；當(dāng)醇油質(zhì)量比繼續(xù)增加至9∶1時(shí)，脂肪酶催化磷脂的乙酯轉(zhuǎn)化率呈現(xiàn)明顯的上升趨勢(shì)，最高乙酯轉(zhuǎn)化率達(dá)到82.13%.當(dāng)醇油質(zhì)量比大于9∶1時(shí)，Novozym 435催化磷脂所得的乙酯轉(zhuǎn)化率反而明顯下降.這主要是因?yàn)橐粋€(gè)乙醇分子含有一個(gè)羥基基團(tuán)，過(guò)多的乙醇分子會(huì)使其羥基基團(tuán)與酶分子的Glu、Arg等氨基酸殘基作用，影響酶分子的空間結(jié)構(gòu)，降低其催化性能.因此，Novozym 435催化微藻磷脂的最佳醇油質(zhì)量比為9∶1.

圖3D評(píng)估了不同反應(yīng)溫度影響Novozym 435催化磷脂性能.當(dāng)反應(yīng)溫度從30 ℃增加到40 ℃時(shí)，固定化脂肪酶Novozym 435催化微擬球藻磷脂的乙酯轉(zhuǎn)化率呈上升趨勢(shì)，從69.66%提高到92.68%.但是，當(dāng)催化體系的反應(yīng)溫度超過(guò)40 ℃，Novozym 435催化所得的乙酯轉(zhuǎn)化率隨反應(yīng)溫度的增加而降低.反應(yīng)溫度為55 ℃時(shí)，Novozym 435催化磷脂所得的乙酯轉(zhuǎn)化率最低，僅為55.01%.這主要原因是過(guò)高的反應(yīng)溫度會(huì)破壞酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)，造成酶的失活，從而降低了反應(yīng)速率[17].因此，由圖3D可知，固定化脂肪酶Novozym 435催化微藻磷脂最適合的反應(yīng)溫度為40 ℃.

圖中小寫(xiě)字母表示顯著性差異，P<0.05圖3 不同酶催化條件對(duì)脂肪酶醇解催微擬球藻磷脂的乙酯轉(zhuǎn)化率的影響Fig.3 Effects of different enzyme catalysis conditions on the FAEEs conversion rates by enzymatic ethanolysis of Nannochloropsis-derived phospholipids

在酶催化反應(yīng)中，為獲得最優(yōu)的反應(yīng)條件，需要考慮反應(yīng)時(shí)間這個(gè)因素.圖3E的結(jié)果為不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)固定化脂肪酶Novozym 435催化微擬球藻磷脂性能的影響.從圖3E可明顯看出，反應(yīng)時(shí)間為2～12 h時(shí)，固定化脂肪酶Novozym 435催化微藻磷脂的乙酯轉(zhuǎn)化率表現(xiàn)上升趨勢(shì)，最高乙酯轉(zhuǎn)化率從66.51%上升到98.33%.當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為12～24 h，脂肪酶催化磷脂所得的乙酯轉(zhuǎn)化率則無(wú)顯著差異.這可能的原因是，當(dāng)催化反應(yīng)進(jìn)行到一定時(shí)間，脂肪酸乙酯的濃度升高，抑制了脂肪酶催化微擬球藻磷脂的性能.因此，基于圖3E的結(jié)果，Novozym 435催化微藻磷脂的最優(yōu)反應(yīng)時(shí)間為12 h.

本研究利用Novozym 435乙醇催化富含EPA微擬球藻磷脂，最高的乙酯轉(zhuǎn)化率為98.33%.本研究工作所得的結(jié)果與Yang等[18]和Yasuda等[19]催化大豆磷脂的結(jié)果存在較大差異[18-19](見(jiàn)表2).這主要是因?yàn)楸疚呐c這兩篇論文的催化反應(yīng)條件不一樣，使Novozym 435表現(xiàn)明顯不同的催化特性(如位置選擇性)，有利于催化磷脂甘油骨架上的sn-1和sn-2脂肪酸，與乙醇反應(yīng)轉(zhuǎn)化為脂肪酸乙酯.Novozym 435在不同催化條件下會(huì)表現(xiàn)sn-1，3位置選擇和非位置選擇兩種催化特性[20].因此，本研究工作中，高濃度的乙醇(乙醇與微擬球藻磷脂質(zhì)量比9∶1)可能是Novzoyme 435催化磷脂表現(xiàn)非位置選擇性的一個(gè)原因.今后將利用蛋白質(zhì)工程、分子模擬等技術(shù)，進(jìn)一步分析Novozym 435催化磷脂的分子機(jī)制，旨在定向研發(fā)新型南極假絲酵母脂肪酶B高值化開(kāi)發(fā)海洋微藻油脂.

表2 Novozym 435催化微擬球藻磷脂和大豆磷脂酰膽堿的結(jié)果比較Tab.2 Comparison of Novozym 435 to catalyze Nannochloropsis phospholipids and soybean phosphatidylcholine

3 結(jié)論

在3種商用固定化脂肪酶中，Novozym 435是最適合乙醇醇解催化富含EPA的微擬球藻磷脂的脂肪酶，其乙酯轉(zhuǎn)化率為52.07%.Novozym 435可獲得最高乙酯轉(zhuǎn)化率的催化條件為：酶加量為磷脂量的15%，含水量為底物總量的2%，醇油質(zhì)量比9∶1，反應(yīng)溫度為40 ℃，反應(yīng)時(shí)間為12 h.在所優(yōu)化的條件下，脂肪酶乙醇醇解催化磷脂的最大乙酯轉(zhuǎn)化率為98.33%.基于本研究的結(jié)果，Novozym 435是一種最有潛力用于乙醇醇解微擬球藻磷脂生產(chǎn)制備EPA的生物催化劑，為今后高值化開(kāi)發(fā)海洋微藻油脂提供依據(jù).