崔路路，陳 貝，喬 琨，王聯(lián)珠，劉智禹

(1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.福建水產(chǎn)研究所，福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361013；3.中國水產(chǎn)科學(xué)院黃海水產(chǎn)研究所，山東 青島 266071)

膠原蛋白是動(dòng)物體細(xì)胞外基質(zhì)中含量最多的蛋白之一，約占動(dòng)物總蛋白的30%，其來源豐富，市售膠原蛋白通常從牛皮和豬皮中提取獲得[1].由于近幾十年牛海綿狀腦病、傳染性海綿狀腦病和口蹄疫等陸地生物疾病的爆發(fā)，以及宗教壁壘等因素限制了陸地生物膠原蛋白及其制品的使用，造成膠原蛋白原料供給不穩(wěn)定[2].海洋生物膠原蛋白可規(guī)避這些問題，并且具有良好的生物安全性、穩(wěn)定性以及生物相溶性，故近幾年膠原蛋白的來源逐漸轉(zhuǎn)向了資源豐富的海洋.

海洋生物膠原肽是海洋生物膠原蛋白通過水解衍生而來的具有多種生物活性的肽類，具有分子質(zhì)量小、易于吸收、生物利用率較高等特點(diǎn)[3]，故在功能性食品、美容護(hù)膚品以及生物醫(yī)藥制品等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用.本文詳細(xì)闡述了海洋生物膠原肽的皮膚保護(hù)功能活性、吸收代謝及安全性研究，揭示了海洋生物膠原肽在化妝品領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用前景，為海洋功能化妝品的研究和應(yīng)用提供理論依據(jù).

1 海洋生物膠原肽概述

膠原蛋白是細(xì)胞外最重要的水不溶性纖維蛋白，構(gòu)成了細(xì)胞外基質(zhì)的骨架.它在細(xì)胞外基質(zhì)中形成半晶體的纖維，參與了復(fù)雜的糖胺聚糖蛋白質(zhì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，給細(xì)胞提供抗張力和彈性，并在細(xì)胞的遷移和發(fā)育中起重要作用.膠原蛋白是由3個(gè)螺旋多肽鏈結(jié)構(gòu)組成，每條多肽鏈都含有1個(gè)或多個(gè)Gly-X-Y氨基酸序列，其中X是代表脯氨酸(Pro)或羥脯氨酸(Hyp)，Y代表任何氨基酸，它的分子質(zhì)量大約為300 ku[2，4-5].

海洋生物膠原蛋白一般存在于海洋動(dòng)物的皮膚、鱗片和骨骼的結(jié)締組織中，其來源大致可以分為2類：一類是來源于海洋脊椎動(dòng)物，如魚類[6]；另一類是來源于海洋無脊椎動(dòng)物，如水母[7]、海參[8]、海膽[9]等.目前發(fā)現(xiàn)海洋生物中膠原蛋白類型有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅸ、Ⅺ型等，其中Ⅰ型最為常見，主要分布于海洋生物的皮膚、軟骨等部位，其余類型的膠原蛋白較少(表1).

表1 不同海洋生物所含膠原蛋白的類型Tab.1 Types of collagen in different marine source

海洋生物膠原蛋白常用的提取方法主要有酸法提取、酶法提取和酸-酶復(fù)合提取等.單獨(dú)利用酸法和酶法提取膠原蛋白產(chǎn)量較低,蛋白酶可水解膠原蛋白末端肽,含三螺旋結(jié)構(gòu)的主體部分由于可溶于有機(jī)酸被提取出來,進(jìn)一步提高膠原蛋白的提取效率.在實(shí)際操作中,大多數(shù)采用酸-酶復(fù)合法提取膠原蛋白,使用較多的是醋酸和胃蛋白酶,分別獲得酸溶性膠原蛋白(acid-soluble collagen，ASC)和酶溶性膠原蛋白(pepsin-soluble collagen，PSC).具體操作步驟如圖1所示.提取膠原蛋白之前，需經(jīng)前處理去除魚皮等原料中的雜質(zhì)、非膠原蛋白和脂質(zhì)物質(zhì)，并將其冷凍干燥.將原料以一定的比例加入醋酸溶液中，在低溫的條件下攪拌、離心，得到的沉淀用同樣的條件再處理一次，合并兩次的上清液，收集沉淀物.上清液用于獲得ASC，沉淀物用于獲得PSC[17-19].

表2列舉了若干海洋生物膠原蛋白的提取方法及提取率.從提取率上看，大部分研究表明海洋生物PSC得率高于ASC，也有少量研究顯示ASC得率高于PSC，例如藍(lán)點(diǎn)馬鮫[20]、霞水母[21]、魷魚[19]和平鰭旗魚魚皮膠原蛋白[22]等.ASC與PSC的得率可能歸因于海洋生物種類和制備方法的差異.ASC和PSC的氨基酸組成結(jié)構(gòu)相似，2種膠原蛋白均以甘氨酸為主要氨基酸，其次為羥脯氨酸、脯氨酸和丙氨酸[19].電泳分析顯示海洋生物ASC和PSC均含有α1、α2、β和γ等主要條帶，其中γ是α鏈的三聚體，β是α鏈的二聚體.從粘度上看，ASC粘度高于PSC[16，23-25]，這是由于酸法提取過程中保留了膠原分子的端肽成分，使得膠原分子內(nèi)纏結(jié)增多，膠原溶液的粘度增高.通過掃描電鏡觀察海洋生物膠原蛋白結(jié)構(gòu)特征表明，ASC和PSC通常在孔徑大小、孔隙率、互連性和表面積等方面具有不同的微觀結(jié)構(gòu)，這使得ASC和PSC可應(yīng)用至不同生物材料領(lǐng)域[18，22].

圖1 海洋生物ASC和PSC的提取方法Fig.1 Extraction of ASC and PSC from marine source

表2 不同海洋生物中膠原蛋白的提取方法及提取率Tab.2 Extraction methods and yield of collagen from different marine source

海洋生物膠原肽是海洋生物膠原蛋白經(jīng)水解衍生而來的具有多種生物活性的肽類，在許多相關(guān)研究中也稱為膠原水解產(chǎn)物.與膠原蛋白相比，膠原肽具有分子質(zhì)量小、易于吸收、生物利用率較高等特點(diǎn).目前海洋生物膠原肽的提取方法主要有酸法、堿法、酶法、水熱抽提、熱壓浸提、中性鹽提取、微生物發(fā)酵法等，其中最常用的是酶法提取.表3列舉了海洋生物膠原肽的提取方法及其優(yōu)缺點(diǎn)[29-32].

表3 海洋生物膠原肽的提取方法及其優(yōu)缺點(diǎn)Tab.3 Extraction method of marine collagen and its advantages and disadvantages

2 海洋生物膠原肽的皮膚保護(hù)功效

2.1 抗氧化活性

同時(shí)在細(xì)胞或動(dòng)物水平也證實(shí)了海洋生物膠原肽的抗氧化活性，如Pozzolini等[39]發(fā)現(xiàn)純化后的海綿膠原蛋白水解物具有抗氧化活性，清除ROS的能力為23%～60%，并且無毒性，故可以用于化妝品行業(yè)中.質(zhì)量濃度為0.2 mg·mL-1條紋斑竹鯊魚皮肽和質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1遮目魚魚鱗膠原肽顯著降低H2O2損傷的HaCAT細(xì)胞內(nèi)ROS水平，細(xì)胞內(nèi)ROS水平分別達(dá)到對(duì)照組的50.9%和12.0%[40-41].紅鯛魚鱗膠原蛋白水解物可以降低丙二醛(MDA)的水平，質(zhì)量濃度分別為1、3、6 mg·mL-1時(shí)，MDA的水平分別降低了13.4%、33.3%和36.9%，同時(shí)超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的水平有所增加，從而達(dá)到抗氧化的效果[42].鮑魚肽ATPGDEG具有清除UVB(ultraviolet radiation B)誘導(dǎo)的HaCAT細(xì)胞內(nèi)ROS的水平，抑制由UVB造成的細(xì)胞DNA損傷[43].

2.2 美白活性

黑色素是存在于皮膚中的天然色素，黑色素的增加可保護(hù)皮膚免受UV的侵害，但是黑色素的過量生成和堆積會(huì)引發(fā)黑斑、黃褐斑、雀斑及惡性黑色素瘤等皮膚問題.黑色素的形成過程與酪氨酸酶(TYR)、二羥基吲哚羧酸氧化酶(TRP-1)以及多巴色素異構(gòu)酶(TRP-2)密切相關(guān)[44].

國內(nèi)外已有研究證明海洋生物膠原肽可通過抑制酪氨酸酶活性減少黑色素的生成.如魷魚魚皮膠原蛋白水解物可以抑制酪氨酸酶的活性，1 mg·mL-1的F3組分(3～10 ku)對(duì)酪氨酸酶的抑制率為39.65%[45].經(jīng)分子篩柱層析分離純化后的文蛤肽Mer1對(duì)酪氨酸酶有較強(qiáng)的抑制作用，從而降低黑色素的含量達(dá)到美白的效果[46].遮目魚魚鱗肽通過抑制酪氨酸酶的活性抑制黑色素的產(chǎn)生[47].分子質(zhì)量在3～10 ku范圍內(nèi)的魷魚魚皮膠原肽具有抑制酪氨酸活性的作用，當(dāng)質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1時(shí)，對(duì)酪氨酸酶的抑制率為39.65%[45].

2.3 減少皮膚膠原蛋白流失

膠原蛋白是構(gòu)成人體皮膚的主要成分，隨著時(shí)間的推移以及外部環(huán)境的影響，膠原蛋白強(qiáng)度和厚度下降成為皮膚老化的主要因素.

Hyp是膠原蛋白的標(biāo)志性氨基酸，Hyp含量降低是老化皮膚的主要標(biāo)志之一.研究證明海洋生物膠原肽可以顯著增加Hyp的含量，從而促進(jìn)皮膚膠原蛋白的合成.Fan等[48]發(fā)現(xiàn)水母傘膠原肽處理經(jīng)UV照射的小鼠，其皮膚中Hyp和膠原蛋白的含量明顯增加.在海洋膠原肽抵抗膠原蛋白流失的作用機(jī)制研究方面，國內(nèi)外已有研究表明海洋膠原肽可以通過一系列信號(hào)通路激活皮膚膠原蛋白合成或抑制皮膚膠原蛋白降解，如太平洋鱈魚魚皮明膠水解物可通過上調(diào)轉(zhuǎn)化生長因子-βⅡ型受體(TGF-βRⅡ)和下調(diào)Smad7水平促進(jìn)Ⅰ型前膠原的合成[49].鮭魚皮膠原肽可以通過激活Smad信號(hào)通路，上調(diào)TGF-βRⅡ的表達(dá)，促進(jìn)Ⅰ型和Ⅲ型膠原mRNA的表達(dá)，降低MMP-1(matrix metalloproteinases-1)的表達(dá)和增加TIMPs(tissue inhibitor of matrix metalloproteinases)的表達(dá)抑制皮膚膠原的降解，延緩皮膚的衰老[50].Wei等[51]從馬氏珠母貝提取膠原肽，經(jīng)過凝膠色譜和反向高效液相純化得到的二肽PH可以降低由UVB誘導(dǎo)的HaCAT細(xì)胞中MMP-1和MMP-3的含量，從而降低膠原蛋白的降解，緩解衰老.從鱈魚魚皮中提取的膠原肽GEIGPSGGRGKPGKDGDAGPK和GFSGLDGAKGD，通過抑制絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號(hào)通路相關(guān)蛋白磷酸化的表達(dá)降低MMP-1的含量[52].鮑魚肽ATPGDEG抑制UVB誘導(dǎo)的HaCAT細(xì)胞內(nèi)MMP-1和MMP-9的活性，通過下調(diào)MAPK信號(hào)通路中c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)和p38絲裂原活化蛋白激酶(p38)蛋白的磷酸化抑制Ⅰ型前膠原蛋白的降解[43].

2.4 抗炎活性

皮膚的脫皮、發(fā)紅、瘙癢、痤瘡等問題大多可歸因于皮膚炎癥.炎癥是人體的防御反應(yīng)，通常情況下是有益的，但如果炎癥長期持續(xù)發(fā)生，將會(huì)導(dǎo)致皮膚狀況的惡化和皮膚屏障的破壞.皮膚炎癥發(fā)生時(shí)，毛細(xì)血管擴(kuò)張，通透性增加，炎癥細(xì)胞和炎癥因子浸潤.

海洋膠原肽具有良好的皮膚抗炎活性.如鮭魚胸鰭肽可以抑制NO(nitric oxide)的合成，降低促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，達(dá)到抗炎作用[53].皮膚經(jīng)UV照射后，白介素-1α(interleukin 1α，IL-1α)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α，TNF-α)的水平顯著提高，Chen等[49]研究了太平洋鱈魚魚皮膠原肽(CH)對(duì)光老化皮膚促炎細(xì)胞因子表達(dá)的影響，結(jié)果顯示CH可以降低IL-1α和TNF-α的水平，降低皮膚炎癥的發(fā)生，這和Ahn等[53]的研究結(jié)果類似，發(fā)現(xiàn)鮭魚胸鰭膠原三肽抑制NO和前列腺素-E2(prostaglandin E2，PGE2)的表達(dá)，抑制率分別為63.80%和45.33%，同時(shí)顯著降低促炎細(xì)胞因子(TNF-α，IL-6，IL-1β)的產(chǎn)生.

2.5 促進(jìn)傷口愈合能力以及組織修復(fù)功能

海洋生物膠原蛋白及其水解物處理UV暴露的皮膚損傷具有良好的修復(fù)功效.研究人員通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)海綿膠原蛋白水解物對(duì)UV照射后損傷的成纖維細(xì)胞和角化細(xì)胞具有傷口愈合能力和組織修復(fù)功能[39]，海蜇和鱈魚皮多肽會(huì)提高細(xì)胞膠原蛋白和透明質(zhì)酸的含量，對(duì)損傷細(xì)胞有修復(fù)作用[54].Chen等[55]通過小鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)三文魚明膠及其水解物對(duì)UV引起的皮膚損傷有修復(fù)作用.水母傘膠原肽可以修復(fù)損傷皮膚中內(nèi)源性膠原和彈性蛋白纖維[48].光裸星蟲膠原肽處理皮層受傷的小鼠，發(fā)現(xiàn)該肽具有修復(fù)傷口愈合能力[56].

3 海洋生物膠原肽吸收代謝及安生性研究

研究表明攝入膠原肽可有效改善人體皮膚狀況，增加皮膚水分，改善皮膚彈性和真皮膠原蛋白的結(jié)構(gòu)，減緩受試女性的黃褐斑[57-59].口服膠原肽后體內(nèi)吸收代謝研究對(duì)闡明其皮膚改善作用機(jī)制具有重要的意義.目前，口服海洋源膠原肽后體內(nèi)吸收代謝研究相對(duì)較少.一項(xiàng)臨床實(shí)驗(yàn)研究表明，志愿者通過口服深海魚皮膠原肽后血液中的Hyp含量顯著升高[57].大部分膠原肽體內(nèi)吸收代謝的研究主要集中于陸生動(dòng)物和淡水魚源膠原肽.研究表明攝入陸生動(dòng)物膠原多肽可在體內(nèi)被吸收進(jìn)入人體循環(huán)系統(tǒng).如牛骨膠原多肽水解產(chǎn)物經(jīng)口服攝入后，血液中膠原性肽的水平顯著升高[60].小鼠攝入豬皮膠原水解物后，發(fā)現(xiàn)皮膚中Pro-Hyp含量升高，血液中Gly-Pro-Hyp含量升高，根據(jù)Pro-Hyp和Gly-Pro-Hyp的濃度最大時(shí)所需要的時(shí)間得出皮膚中Pro-Hyp是由血液中Gly-Pro-Hyp水解而來[61].小鼠口服魚類膠原或膠原肽后，在血液和皮膚中可檢測(cè)到膠原肽片段.例如研究人員利用14C標(biāo)記的鰱魚皮膠原蛋白來確定小鼠的代謝過程，在皮膚成纖維細(xì)胞中檢測(cè)到含有Hyp的肽，這表明膠原肽在體內(nèi)到達(dá)了皮膚靶細(xì)胞[62].小鼠口服魚鱗膠原肽后，發(fā)現(xiàn)其血液中的Gly-Pro和Pro-Hyp的含量顯著增加[63].目前未檢索到海洋生物膠原肽與陸地生物膠原肽攝入機(jī)體后的代謝差異報(bào)道，針對(duì)該問題仍需進(jìn)一步地探索研究.

目前已通過細(xì)胞、動(dòng)物等不同水平實(shí)驗(yàn)證明海洋生物膠原肽毒副作用小的特性.在細(xì)胞水平，質(zhì)量濃度為10 μg·mL-1和50 μg·mL-1的海綿膠原肽對(duì)L929成纖維細(xì)胞和HaCAT角質(zhì)化細(xì)胞無毒性并顯著促進(jìn)細(xì)胞的增長[39].質(zhì)量濃度在0.25～20 μg·mL-1的范圍內(nèi)，分子質(zhì)量低于30 ku的海蜇膠原對(duì)人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞(HEKa)沒有毒性，而分子質(zhì)量高于30 ku的海蜇膠原在質(zhì)量濃度大于1 μg·mL-1對(duì)HEKa有毒性[64]；質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%的鮭魚魚皮膠原多肽灌胃小鼠，沒有慢性毒性的風(fēng)險(xiǎn)[65].質(zhì)量濃度高達(dá)0.5 g·mL-1的雙斑東方鲀魚皮膠原肽經(jīng)過多次皮膚刺激和急性眼刺激的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明膠原肽對(duì)兔眼和皮膚均沒有刺激性[27].

4 總結(jié)與展望

海洋生物膠原肽具有良好的抗氧化、美白、抗炎、促進(jìn)組織修復(fù)等皮膚保護(hù)功效，在外用和口服化妝品領(lǐng)域均有巨大的應(yīng)用前景.目前大多數(shù)海洋源膠原肽仍處于實(shí)驗(yàn)研發(fā)階段，仍存在分子質(zhì)量超過皮膚理想截留分子質(zhì)量、油水分配系數(shù)較低、皮膚滲透性差、口服吸收代謝規(guī)律研究不夠深入等問題.

未來充分探究海洋膠原肽皮膚滲透吸收特性及穩(wěn)定性，克服皮膚屏障，安全有效地將肽類分子運(yùn)送至皮膚靶細(xì)胞，明確口服后吸收、代謝、分布、排泄規(guī)律，是海洋膠原肽化妝品研究領(lǐng)域研發(fā)的重點(diǎn)和難點(diǎn).海洋生物膠原肽化妝品的商業(yè)化對(duì)實(shí)現(xiàn)海洋生物加工副產(chǎn)物的深度開發(fā)利用，提升經(jīng)濟(jì)附加值及構(gòu)建現(xiàn)代化海洋產(chǎn)業(yè)鏈均具有積極的意義.