王艷英，田周萍 ，康臆玲 ，陳慧斌 ，黃鷺強

(1.福建師范大學生命科學學院，福建 福州 350117；2.華南理工大學材料工程學院，廣東 廣州 510641；3.中山大學生命科學學院，廣東 廣州 510275)

羊棲菜(Sargassumfusiforme)是一類暖溫帶海域一年生大型海藻.羊棲菜中含的多酚具有抗炎、抑制腫瘤生長、降低血糖[1]、抗氧化[2]等活性.多酚是一種天然的強抗氧化劑，結構單元為間苯三酚，其中·OH作為褐藻多酚化學性質和生物活性的特征官能團，羥酚基可作為氫供體[3]，參與氧化過程并產(chǎn)生自由基反應形成穩(wěn)定羧酸或水，也可以在氧化起始階段抑制自由基產(chǎn)生或與金屬離子絡合，從而發(fā)揮抗氧化作用[4].王君虹等[5]對微波-浸提輔助法羊棲菜多酚展開研究，在該工藝下羊棲菜多酚得率可達2.33%.蔡圣寶等[6]研究發(fā)現(xiàn)超聲波提取法下不同因素條件對褐藻多酚提取率影響不同，其中對羊棲菜褐藻多酚浸提量影響最深的為料液比和超聲功率.張麗斌等[7]為得到較為單一的組分，通過比較10種不同型號樹脂的靜態(tài)吸附量與動態(tài)解吸率，分析出型號為XDA-7的大孔樹脂對羊棲菜多酚表現(xiàn)出較強的吸附與解吸能力，進而確定較為適宜的羊棲菜多酚大孔樹脂柱層析工藝條件.

體外抗氧化活性的評估接近真實的物理環(huán)境，包括特定的pH、溫度和環(huán)境濕度[8-9].其中，細胞氧化模型也已廣泛運用于研究植物化學物質與人類健康有關的潛在機制[10]，有效的抗氧化劑攝入可以保護機體免受自由基的影響，并調節(jié)氧化還原平衡[11-12].王長秀等[13]研究發(fā)現(xiàn)中、高用量的羊棲菜多酚對S-180荷瘤小鼠的瘤生長具有一定的抑制效果；有研究表明[14]，褐藻多酚對受鉛威脅的上海青生長及抗氧化系統(tǒng)起作用，能緩解鉛對上海青造成的氧化損傷與毒害作用；Yang等[15]制備的螺旋藻-SeNPs在水溶液中可穩(wěn)定保存3個月，可通過誘導細胞凋亡抑制癌細胞增殖.本研究以羊棲菜為原料，采用不同提取方法考察其制備方案，通過純化獲得多酚提取物，并測定其體外抗氧化能力，開展Caco-2細胞氧化損傷模型的抗氧化評價[16]，可為拓展羊棲菜多酚的開發(fā)和利用提供參考依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羊棲菜(Sargassumfusiforme)，干制品，福建省水產(chǎn)研究所惠贈；Caco-2 (克隆人結直腸腺癌細胞)，福建農(nóng)林大學食品科學學院惠贈.

1.2 儀器

LGJ-10型真空冷凍干燥機，北京松源華興科技；XH-300A型電腦微波超聲波組合合成儀，北京祥鵠科技；DHL-A電腦數(shù)顯恒流泵，DBS-100電腦全自動部分收集器，上海滬西分析儀器廠有限公司；RC600型旋轉蒸發(fā)儀，凱恩孚科技(上海)有限公司；5418R型超高速冷凍離心機，EPPENDORF公司；OPTIMA型酶標儀，德國BMG FLUOstar；MCO-170AICDL-PC型細胞培養(yǎng)箱，日本Panasonic公司；388A 型-80 ℃超低溫冰箱，青島海爾集團有限公司.

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品制備

將羊棲菜冷凍干燥30 h左右，用研磨機進行粉碎，過80目篩，包裝于真空密封袋，稱質量，保存至-20 ℃待用，得到粗多酚.

1.3.2 不同浸提方式和不同料液比對粗多酚浸出率的影響

根據(jù)不同浸提方式對粗多酚浸出率的變化影響，在料液比(1∶20)、乙醇(體積分數(shù)40%)、提取溫度(70 ℃)相同的條件下，分別精確稱量1.00 g羊棲菜粉末加入20 mL體積分數(shù)40%乙醇中，于水浴鍋中浸提60 min，超聲波提取30和60 min.取10.00 g羊棲菜粉末于200 mL體積分數(shù)40%乙醇中，在微波功率600 W下持續(xù)加熱5 min.3 500 r·min-1離心10 min，重復3次，取上清液，稀釋50倍.

同時，為比較不同料液比所帶來的影響，配制350 mL的體積分數(shù)60%的無水乙醇，稱取羊棲菜粉末2.00 g，依次按照料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35混勻.在超聲功率200 W，70 ℃的條件下，浸提60 min.3 500 r·min-1離心10 min，取上清液并稀釋50倍.

1.3.3 羊棲菜粗多酚浸出率的測定

采用福林酚法測定羊棲菜粗多酚浸出率，以沒食子酸為標準品.分別吸取1.3.2中不同質量濃度溶液、蒸餾水和羊棲菜溶液各1 mL到10 mL的比色管中，在每個比色管加入5 mL的10%福林酚試劑，搖勻.反應3～8 min內，加入4 mL 7.5%Na2CO3搖勻.室溫下放置60 min，在765 nm波長條件下用分光光度計測其吸光度值(A).以吸光度為縱坐標，沒食子酸濃度為橫坐標，繪制標準曲線，計算得出線性回歸方程為Y=0.009 4X+0.083 7(R2=0.999 5).樣品中多酚浸出率按照公式(1)計算．

(1)

式中：A為待測液的吸光度，V為羊棲菜提取液體積，d為稀釋因子，k為沒食子酸標準曲線的斜率，M為樣品干物質的含量(%)，m為羊棲菜的質量(g)．

1.3.4 羊棲菜粗多酚的純化

1.3.4.1 大孔樹脂吸附預處理

將XDA-7型大孔吸附樹脂在體積分數(shù)95%的乙醇溶液中浸泡20 h，雙蒸水清洗去除乙醇，后用5% HCl溶液洗滌大孔吸附樹脂3 h，過濾保留大孔吸附樹脂；洗至溶液呈中性，再用3～5倍大孔吸附樹脂體積的NaOH(體積分數(shù)6%)洗柱3 h，洗滌沉淀大孔吸附樹脂至流出液pH=7，過濾保留大孔吸附樹脂.

1.3.4.2 濃縮

將羊棲菜多酚粗提液進行初步過濾并用旋轉蒸發(fā)儀進行旋蒸，將旋蒸得到的產(chǎn)物緩慢加入250 mL蒸餾水，利用超聲波將貼壁的多酚溶解下來，在11 000 r·min-1條件下離心15 min，取上清液，進行濾膜抽濾，取1 mL待測液進行梯度稀釋，置于酶標儀中進行吸光值測定以確定待測液的含量.

1.3.4.3 上柱與回收

將羊棲菜多酚提取液用雙蒸水稀釋至3 mg·mL-1的質量濃度[17]，用錫紙包裹層析柱，以1 BV·h-1的上樣流速將羊棲菜多酚提取液上柱吸附，吸附完全用雙蒸水沖洗直至流出溶液為無色.用體積分數(shù)60%的乙醇洗脫液進行洗脫，回收相應管洗脫液，后進行濃縮并冷凍干燥，稱取適量凍干粉溶解于水得到樣品母液，進行梯度稀釋，利用福林酚法計算純度.

1.3.5 抗氧化活性評價

為探討羊棲菜多酚的體外抗氧化能力，以間苯三酚為標準品，Vc為參照物進行羊棲菜多酚體外抗氧化活性評價.

1.3.5.1 總抗氧化能力

將羊棲菜多酚、Vc、間苯三酚分別溶于雙蒸水并進行梯度稀釋，依次得到100～1 000 μg·mL-1的待測液，依據(jù)T-AOC檢測試劑盒提供的方法檢測總抗氧化能力.

1.3.5.2 抑制羥自由基能力

將羊棲菜多酚、Vc、間苯三酚分別溶于雙蒸水并進行梯度稀釋，依次得到100～1 000 μg·mL-1的待測液，依據(jù)羥自由基(·OH)檢測試劑盒提供的方法測定羥自由基能力.

1.3.5.3 抑制超氧陰離子能力

1.3.6 Caco-2細胞評價羊棲菜多酚抗氧化作用

1.3.6.1 Caco-2細胞培養(yǎng)

克隆人結腸直腸腺癌細胞Caco-2用含有體積分數(shù)為10%胎牛血清的培養(yǎng)液，于37 ℃、體積分數(shù)5%的CO2條件下培養(yǎng)傳代.

1.3.6.2 細胞活力測定

為了檢測羊棲菜多酚對炎性細胞因子釋放的影響，方法參照CCK-8檢測試劑盒并略有調整.其中，設計實驗組(細胞液+藥物+CCK-8)，藥物顏色對照組(培養(yǎng)基+藥物+CCK-8)，空白組(細胞液+CCK-8)，零組(培養(yǎng)基+CCK-8)，實驗組和空白組中加入100 μL細胞液，其他孔加入100 μL培養(yǎng)基，在加樣孔的外圈加入PBS防止培養(yǎng)基蒸發(fā).后將96孔板放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜至細胞狀態(tài)恢復穩(wěn)定.實驗組與對照組依次加入質量濃度為0、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1 mg·mL-1的羊棲菜多酚、兒茶素、間苯三酚水溶液處理6 h，H2O2處理3 h，使用酶標儀測量D450 nm值.如細胞存活率大于等于90%，說明樣品溶液沒有細胞毒性，樣品濃度安全[18].

1.3.6.3 血清的收集

細胞鋪板6孔板，設計空白組(細胞液)，刺激組(細胞液+過氧化氫)，藥物組(細胞液+藥物)及藥物對照組(細胞液+藥物+過氧化氫)，在每組加入1 mL細胞液，然后將96孔板放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng).在藥物組和藥物對照組中分別加入羊棲菜多酚、兒茶素、間苯三酚，刺激6 h，再向刺激組、藥物對照組中加入H2O2刺激3 h.將每孔中的血清收集在EP管中，用于后續(xù)指標檢測.

1.3.7 抗氧化酶指標檢測

根據(jù)試劑盒提供的方法測定細胞培養(yǎng)上清液中的丙二醛(MDA)、過氧化氫酶(CAT)、總超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)，評價羊棲菜多酚的體外抗氧化能力.

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

通過SPSS軟件中的單因素方差分析(ANOVA)對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，結果以“平均數(shù)±標準差”形式表述，數(shù)據(jù)重復3次；所有圖形采用Origin 2021軟件進行繪制.

2 結果與分析

2.1 不同提取方法與不同料液比對羊棲菜多酚浸出率的影響

在相同料液比(1∶20)、相同溶劑(體積分數(shù)40%乙醇)、相同提取溫度(70 ℃)的相同實驗條件下，用超聲波提取60 min所得浸出率最高，為12.47%(見圖1a)，表明超聲波可增強對海藻中提取羊棲菜多酚的能力[19].由圖1b得知，當料液比為1∶20～1∶30之間，浸出率大幅度上升，且料液比為1∶30時羊棲菜多酚浸出率最高，達7.65%，說明多酚與溶劑充分接觸使大部分物質都被提取出.因此，在綜合考慮下選取最佳料液比為1∶30.

圖1 不同提取方法與不同料液比對羊棲菜多酚浸出率的影響Fig.1 Effects of several extraction methods and different material-to-liquid ratios on how quickly polyphenols from Sargassum fusiforme

2.2 大孔吸附樹脂分離羊棲菜多酚結果

收集流出液，280 nm測定吸光度，經(jīng)XDA-7型大孔樹脂柱層析純化、冷凍干燥后的羊棲菜多酚質量濃度達29.94 mg·mL-1，純度達到(21.45±0.56)%.

2.3 羊棲菜多酚的體外抗氧化活性能力

總抗氧化活性測定通常用于確定天然產(chǎn)品(如多酚和多糖)的抗氧化能力[20].以Vc和間苯三酚作為對照組，將羊棲菜粗多酚進行梯度稀釋，測定不同濃度下的羥自由基的抑制率和超氧陰離子清除能力，結果見圖2.在圖2a可以看出三者的抑制能力都隨濃度的增大而升高，羊棲菜多酚對羥自由基的抑制能力大于Vc和間苯三酚，表明羊棲菜多酚類含有大量酚羥基，具有很強的還原性，能夠抑制氧化反應[21]；超氧陰離子清除能力見圖2b，在400～800 μg·mL-1范圍內，羊棲菜多酚對超氧陰離子的清除能力呈現(xiàn)穩(wěn)定上升狀態(tài)，說明純化后的多酚能有較強的清除作用.羊棲菜多酚的總抗氧化值為69.69 U·mL-1，體現(xiàn)出較好的抗氧化活性．

圖2 羊棲菜多酚、間苯三酚、Vc對·OH抑制率(a)與清除能力(b)的比較Fig.2 Comparison of·OH inhibition (a) capacity (b)of Sargassum fusiforme polyphenols，m-benzotriazoles and Vc

2.4 羊棲菜多酚對H2O2誘導的Caco-2細胞活力的影響

為了檢測羊棲菜多酚對炎性細胞因子釋放的影響，選取0、0.001、0.005、0.01 、0.05、0.1 mg·mL-1質量濃度的純多酚分別刺激Caco-2細胞，結果見圖3.

圖3 CCK-8 法檢測藥物對Caco-2細胞活力的影響Fig.3 The effect of drugs on the viability of Caco-2 cells was detected by CCK-8 method

如圖3a所示，添加不同質量濃度的H2O2處理Caco-2 細胞后，細胞活度明顯下降，說明H2O2不僅能夠直接氧化脂質和蛋白質，導致細胞損傷和死亡，提高其質量濃度還會導致對Caco-2 細胞的損傷；圖3c為羊棲菜多酚，其誘導的Caco-2細胞活力均在80%～90%范圍內，表明該質量濃度范圍對細胞無明顯的毒性，不會影響活力.從而選定0.01 mg·mL-1的質量濃度作為后續(xù)試驗刺激條件，選擇0.01 mg·mL-1的質量濃度作為間苯三酚后續(xù)試驗刺激條件；選擇0.005 mg·mL-1的質量濃度作為兒茶素后續(xù)試驗刺激條件；選擇0.005 mg·mL-1的質量濃度作為H2O2后續(xù)試驗刺激條件.

2.5 羊棲菜多酚對H2O2誘導的Caco-2細胞氧化還原狀態(tài)的影響

Caco-2細胞能夠有力的與腸細胞壁的活躍膜運輸聯(lián)系，維護機體的氧化還原平衡[22].經(jīng)過刺激處理后，MDA的濃度有明顯上升，CAT、SOD和GSH-Px活性均有下降趨勢．結果如圖4所示.

經(jīng)過H2O2誘導后，藥物刺激組中MDA濃度較空白組高(圖4a)，最高為(13.86±2.83) nmol·mL-1，一般正常上清液MDA處于較低水平，而在受傷或應激細胞的上清液中，細胞受自由基的刺激產(chǎn)生大量的MDA；而藥物處理組中羊棲菜MDA濃度(2.45±1.38)nmol·mL-1與空白組相比濃度較高，說明在細胞受到刺激時，先加入羊棲菜多酚的細胞能夠較少產(chǎn)生MDA，減少細胞受到應激作用；CAT活力的增加與氧化應激的反應有關[23]，在空白對照組中，藥物處理組體內CAT活力值均顯著升高，其中兒茶素處理組CAT值為(26.82±4.79)U·mL-1(圖4b)，在羊棲菜多酚的干預下，抗氧化酶活性顯著升高，能夠抵御H2O2對抗氧化防御系統(tǒng)的損害，這結果與Zhang等[24]研究的抗氧化活性一致.SOD可以預防細胞中的有害氧，圖4c中各處理組SOD活力值均顯著升高；GSH-Px是保護細胞膜免受脂質過氧化的主要抗氧化酶[25]，通過和空白對照組GSH-Px活力值(2.33±0.21)U·mL-1相比，刺激組機體內GSH-Px活力值(1.37±0.45)U·mL-1顯著下降(圖4d)，導致細胞引起損傷而使得谷胱甘肽氧化酶活力降低.

3 結論