柴嘉擎 王趙偉 吳承龍 蔣琦 王鑫

作者單位：312000 紹興文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院（柴嘉擎），紹興市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（王趙偉、吳承龍），輸血科（蔣琦），風(fēng)濕免疫科（王鑫）

多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病，也是造成青壯年非創(chuàng)傷性殘疾的主要原因之一[1]。目前MS 的發(fā)病機(jī)制還不明確，但普遍認(rèn)為遺傳和環(huán)境危險(xiǎn)因素共同參與疾病的發(fā)生、發(fā)展[2]。近年來MS 患病率呈現(xiàn)不斷上升趨勢，這強(qiáng)烈提示環(huán)境因素的影響權(quán)重在不斷加大。此外，盡管已有多種修飾性治療藥物可減少M(fèi)S 復(fù)發(fā)，但仍無法控制病情進(jìn)展。因此如何預(yù)防疾病，尋找根治疾病的手段是現(xiàn)階段兩大研究熱點(diǎn)。而明確MS 環(huán)境危險(xiǎn)因素可為上述研究熱點(diǎn)提供新的思路。目前認(rèn)為MS潛在環(huán)境危險(xiǎn)因素包括煙草煙霧[3]、維生素D 缺乏[4]、EB 病毒感染[5]、肥胖等。其中煙草煙霧是最為關(guān)注的MS 可控性危險(xiǎn)因素，但兩者是否存在確切因果關(guān)系還不明確。因此，有必要進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，探明煙草煙霧是否促進(jìn)MS 自身免疫反應(yīng)的激活以及內(nèi)在的細(xì)胞免疫學(xué)機(jī)制。

筆者團(tuán)隊(duì)前期通過MS 動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）的研究發(fā)現(xiàn)，幼年期煙草煙霧暴露會(huì)加重成年期EAE 癥狀[6-7]。筆者團(tuán)隊(duì)還發(fā)現(xiàn)成年大鼠EAE 免疫啟動(dòng)后被動(dòng)吸入煙草煙霧也會(huì)加重EAE 癥狀[8-9]，提示MS 患病后被動(dòng)吸入煙草煙霧可促進(jìn)自身免疫性神經(jīng)炎癥損傷。但煙草煙霧被動(dòng)吸入是否促進(jìn)EAE 免疫啟動(dòng)，與CD4+T 亞型分化改變是否有關(guān)尚未明確。為明確上述議題，筆者團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了本實(shí)驗(yàn)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 清潔級豚鼠（8 只，5 周齡）、成年SD 大鼠（30 只，8 周齡，雌、雄不拘）均購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。豚鼠僅用于取脊髓組織用于后續(xù)EAE 造模。30 只SD 大鼠按照體重排序，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為煙草組、空氣組和空白對照組3 組，每組10 只。本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理辦法和紹興市人民醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)的方案實(shí)施（批件號：2020-25）。所有大鼠均飼養(yǎng)于SPF 級屏障系統(tǒng)，室內(nèi)環(huán)境溫度（22±2）℃，每天14 h 的光照，早上7：00 開燈。

1.2 試劑及儀器 完全弗氏佐劑（批號：F5881）、IL-17F（批號：RAB1906）與IL-10（批號：RAB0246）ELISA試劑盒均購自美國Merck 公司；HE 染色（批號：G1001-100 ML）試劑盒、監(jiān)牢藍(lán)（luxol fast blue，LFB）髓鞘染色（LFB 染色，批號：G1030-100ML）試劑盒均購自塞維爾生物科技有限公司（中國）；熒光標(biāo)記叉頭蛋白P3（forkhead box protein P3，F(xiàn)OXP3）（批號：NB100-39002PE）抗體試劑盒購自美國Novus Biologicals 公司，CD4(批號：F3100403)購自聯(lián)科生物有限公司（中國）；FACSCanto 流式細(xì)胞儀購自美國BD 公司；酶標(biāo)儀購自美國Bio-RAD 公司；市售普通卷煙（每支含有尼古丁1 mg，焦油11 mg，一氧化碳11 mg）。

1.3 EAE 模型 豚鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉溶液麻醉，再左心室灌注0.9%氯化鈉溶液處死，分離新鮮脊髓后，與無菌0.9%氯化鈉溶液1∶1 混合后勻漿，4 ℃冷藏備用。脊髓勻漿液與完全弗氏佐劑等體積混合，采用注射器反復(fù)抽打的方法制作成“油包水”乳劑。SD大鼠經(jīng)3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后用上述乳劑進(jìn)行皮下注射，劑量為0.4 ml/只。EAE 模型制作的當(dāng)天計(jì)為造模后第0 天。

1.4 被動(dòng)吸煙模型制作 參考本實(shí)驗(yàn)室前期方法[6]，將市售普通卷煙產(chǎn)生的側(cè)流煙霧先在調(diào)控?zé)熐粶? min，再與過濾的壓縮空氣混合，混合后的煙草煙霧導(dǎo)流到暴露煙腔。煙草組大鼠在暴露煙腔內(nèi)滯留1 h/次，2 次/d。被動(dòng)吸煙期間煙草煙霧的尼古丁濃度、懸浮顆粒和一氧化碳平均濃度為（112±28）μg/m3、（1.24±0.17）mg/m3、（6.70±0.41）ppm?？諝饨M與空白對照組留置于過濾壓縮空氣中。

1.5 實(shí)驗(yàn)干預(yù) 煙草組在EAE 造模前1 周連續(xù)被動(dòng)吸入煙草煙霧7 d 后進(jìn)行EAE 造模；空氣組在EAE 造模前連續(xù)吸入過濾壓縮空氣7 d 后進(jìn)行EAE 造模：空白對照組在EAE 假造模（用0.9%氯化鈉溶液代替豚鼠脊髓勻漿液處理大鼠）前連續(xù)吸入過濾壓縮空氣7 d 后進(jìn)行EAE 假造模處理。EAE 造模后每日觀察大鼠行為學(xué)變化，并在造模后第1～20 天按照EAE行為學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分，其中0 分為無明顯活動(dòng)異常，1 分為尾部出現(xiàn)無力癥狀，2 分為輕微后肢無力癥狀，3 分為嚴(yán)重的后肢麻痹，4 分為四肢麻痹，5 分為瀕死或死亡。

1.6 病理學(xué)檢測 EAE 造模后第21 天，所有大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉后，左心室灌注0.9%氯化鈉溶液處死，分離脊髓組織并于40 g/L 多聚甲醛溶液中固定24 h，經(jīng)乙醇梯度脫水、石蠟包埋等處理后切片（厚度5 μm）。HE 染色：石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟等處理后，按照試劑盒說明書提供的方法，進(jìn)行蘇木素與伊紅染色、乙醇梯度脫水、二甲苯透明、中性樹膠固封等處理。在光學(xué)顯微鏡下觀察頸髓、胸髓、腰髓切片炎癥反應(yīng)。按照如下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行HE 染色病理評分：0 分為無炎癥改變，1分為炎性細(xì)胞浸潤局限于血管周圍和腦膜，2 分為脊髓實(shí)質(zhì)輕度炎性細(xì)胞浸潤（1～10 個(gè)細(xì)胞/切片），3分為脊髓實(shí)質(zhì)中度炎性細(xì)胞浸潤（＞10～100個(gè)細(xì)胞/切片），4 分為脊髓實(shí)質(zhì)重度炎性細(xì)胞浸潤（＞100 個(gè)細(xì)胞/切片）。LFB 染色：石蠟切片脫蠟至水、切片進(jìn)入預(yù)熱的髓鞘染液A 中65 ℃染色4 h、水洗、髓鞘染液B 快速分化5 s、髓鞘染液C 中快速分化10 s，交替浸入髓鞘染液B 和髓鞘染液C 中進(jìn)行分化，鏡檢直至髓鞘呈藍(lán)色背景近無色，然后水洗終止分化。切片經(jīng)3 次無水乙醇脫水，5 min/次，再經(jīng)二甲苯透明5 min，然后用中性樹膠封片。采用Image J 軟件分析脊髓白質(zhì)區(qū)脫髓鞘百分比。

1.7 流式細(xì)胞檢測 分離脾臟細(xì)胞后用尼龍網(wǎng)過濾去除細(xì)胞團(tuán)塊，按照試劑盒說明書提供的方法，加入熒光標(biāo)記CD4 抗體、FOXP3 抗體。已知CD4 與FOXP3陽性表達(dá)的調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（regulatory cells,Treg）是EAE的免疫抑制性淋巴細(xì)胞。通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，采用FlowjoV 10.6.2 軟件分析CD4 與FOXP3 陽性淋巴細(xì)胞百分比。

1.8 細(xì)胞因子IL-17F、IL-10 水平檢測 采用ELISA法。大鼠麻醉后用注射器從腦池中提取腦脊液。腦脊液樣品在液氮中快速冷凍，并在-80 ℃環(huán)境下保存。按照試劑盒說明書提供的方法檢測IL-17F、IL-10 水平，最后使用上述酶標(biāo)儀測量光密度。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 8 統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料組間比較采用Fisher 確切概率法。日均行為學(xué)評分比較采用兩因素重復(fù)測量的方差分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 煙草煙霧暴露對EAE 行為學(xué)評分的影響 空白組大鼠在觀察期內(nèi)均未出現(xiàn)神經(jīng)功能損害的表現(xiàn)，行為學(xué)評分均為0，因此，后續(xù)行為學(xué)評分比較僅納入煙草組與空氣組數(shù)據(jù)。其中煙草組EAE觀察期內(nèi)最高行為學(xué)評分高于空氣組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；但兩組發(fā)病潛伏期和發(fā)病率比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表1。進(jìn)一步對每日行為學(xué)評分比較發(fā)現(xiàn)，EAE 造模后的第12、13 天評分均高于空氣組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表2。

表1 煙草煙霧暴露對EAE發(fā)病潛伏期及最高行為學(xué)評分的影響

表2 煙草煙霧暴露對EAE日均行為學(xué)評分的影響（分）

2.2 煙草煙霧暴露對EAE 脊髓炎癥與脫髓鞘的影響 HE 染色顯示，空氣組脊髓組織切片可見播散性分布的單個(gè)核細(xì)胞，部分區(qū)域可見炎癥細(xì)胞聚集；煙草組脊髓組織切片可見大量的炎癥細(xì)胞聚集，嚴(yán)重的區(qū)域可以觀察到圍繞小血管分布的炎癥細(xì)胞聚集，形成“淋巴袖套”；空白對照組未見髓鞘脫失與炎癥細(xì)胞聚集，見圖1（插頁）。煙草組頸髓、胸髓、腰髓HE 染色病理評分和脫髓鞘百分比均高于空氣組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表3。

圖1 煙草煙霧暴露對EAE 脊髓炎癥與脫髓鞘的影響

表3 煙草煙霧暴露對EAE脊髓炎癥與脫髓鞘損傷的影響

2.3 煙草煙霧暴露對CD4+T 細(xì)胞分化的影響 煙草組抗炎的CD4+FOXP3+T 細(xì)胞百分比低于空氣組，而具有致病性的CD4+FOXP3-T 細(xì)胞百分比高于空氣組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表4。

表4 煙草煙霧暴露對CD4+T細(xì)胞分化的影響（%）

2.4 煙草煙霧暴露對腦脊液細(xì)胞因子的影響 煙草組腦脊液IL-17F 水平高于空氣組，IL-10 水平低于空氣組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表5。

表5 煙草煙霧暴露對腦脊液細(xì)胞因子的影響（pg/ml）

3 討論

MS 是一種神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病，目前無法預(yù)防疾病和控制病情進(jìn)展。近年來，全球MS 患病率有不斷擴(kuò)大趨勢[10]，可能和社會(huì)環(huán)境、生活方式的改變有關(guān)聯(lián)，已引起廣泛關(guān)注。Lorefice 等[11]觀察性研究關(guān)注到煙草煙霧暴露與MS 發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)。但也有矛盾的研究結(jié)果，Koch 等[12]研究認(rèn)為吸煙與MS 疾病殘疾癥狀惡化、認(rèn)知功能減退無關(guān)。由于觀察性研究容易受到回顧性偏倚、選擇性偏倚等混雜因素干擾，因此不能簡單地將相關(guān)性認(rèn)同為因果性[13]。孟德爾隨機(jī)化研究是一種可以推斷相關(guān)性是否存在因果性的流行病學(xué)研究方法。但孟德爾隨機(jī)化研究對于煙草煙霧暴露和MS 發(fā)病的因果關(guān)系，結(jié)論也存在矛盾[14]?？偟膩碚f煙草煙霧與MS 風(fēng)險(xiǎn)增加、疾病惡化是否存在因果關(guān)系還不明確。

本研究在EAE 誘導(dǎo)前給予煙草煙霧暴露，模擬真實(shí)環(huán)境條件下煙草煙霧短期暴露對MS 發(fā)病的影響，以明確煙草煙霧是否促進(jìn)EAE 免疫啟動(dòng)。結(jié)果顯示，與空氣組比較，煙草組EAE 急性期神經(jīng)功能受損癥狀更為嚴(yán)重。由于EAE 發(fā)病導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)功能受損，會(huì)干擾記憶、焦慮、抑郁等動(dòng)物行為學(xué)檢測結(jié)果，無法準(zhǔn)確、全面評估腦高級功能方面的影響，是本研究存在的客觀局限性。但后續(xù)病理學(xué)檢查覆蓋了各脊髓節(jié)段，分析了炎癥和脫髓鞘情況，可以發(fā)現(xiàn)亞臨床病變一定程度上彌補(bǔ)了行為學(xué)觀察造成的偏倚。本研究發(fā)現(xiàn)，煙草組脊髓組織中有更多的炎癥細(xì)胞聚集，脫髓鞘也更嚴(yán)重，可見煙草煙霧促進(jìn)了EAE 脊髓自身免疫攻擊，加重了疾病癥狀和脊髓病理損傷。

細(xì)胞免疫參與介導(dǎo)MS 中樞炎癥反應(yīng)，其中CD4+T細(xì)胞是關(guān)鍵的免疫細(xì)胞，可分為不同亞型，包括Th1、Th2、Th17 和Treg。Th17 細(xì)胞可分泌IL-17A、IL-17F、IL-22 等促炎癥因子，促進(jìn)神經(jīng)炎癥[15]。MS 患者腦脊液中Th17 細(xì)胞數(shù)量明顯增加，被認(rèn)為是MS/EAE 的致病細(xì)胞[16]。Treg 細(xì)胞可以分泌IL-4、IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子-β 等抗炎細(xì)胞因子，被認(rèn)為是MS/EAE 的抑炎細(xì)胞[17]。最近一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)煙草煙霧可通過肺-免疫-腦軸調(diào)控中樞神經(jīng)免疫反應(yīng)[18]。還有研究發(fā)現(xiàn)煙草煙霧通過影響適應(yīng)性免疫反應(yīng)，改變Th17/Treg 細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡[19]。本研究通過流式細(xì)胞術(shù)分析EAE 大鼠脾臟來源的CD4+T 細(xì)胞亞群，發(fā)現(xiàn)煙草組抑制CD4 與FOXP3雙陽性的Treg 細(xì)胞分化，促進(jìn)自身免疫反應(yīng)的CD4+FOXP3-T 細(xì)胞分化。進(jìn)一步通過ELISA 法檢測腦脊液發(fā)現(xiàn)，煙草組腦脊液致炎性IL-17F 水平升高，而IL-10水平下降。因此，煙草煙霧對EAE 免疫啟動(dòng)階段的影響可能與Treg/Th17 細(xì)胞亞群失調(diào)有關(guān)。

綜上所述，發(fā)病前被動(dòng)吸入煙草煙霧造成了EAE運(yùn)動(dòng)功能損害癥狀加重、中樞炎癥反應(yīng)和脫髓鞘損害加劇。煙草煙霧可能通過抑制Treg 細(xì)胞分化，促進(jìn)促炎因子IL-17A 釋放，減少抗炎因子IL-10 釋放，造成EAE 病情惡化。這與以往吸煙和暴露于煙草煙霧環(huán)境中會(huì)使MS 的患病風(fēng)險(xiǎn)增加的研究結(jié)果[20-21]具有一致性，但考慮到觀察性研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)都存在一定局限性，有必要進(jìn)行大樣本臨床研究，并結(jié)合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)深入機(jī)制探討。