范鑫宇,任曉蕾,霍金海,孫國東,王偉明

(黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院·黑龍江 哈爾濱 150036)

滿山紅為杜鵑花科杜鵑花屬植物興安杜鵑RhododendrondauricumL.的干燥葉,收錄于歷版《中華人民共和國藥典》,具有祛痰、止咳的功效,常用于治療急慢性支氣管炎,主要分布于黑龍江、吉林、遼寧、內(nèi)蒙古等省區(qū)[1-2]。滿山紅主要含有黃酮類、揮發(fā)油類化合物,經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)還具有鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗癌等功效[3]。滿山紅含有黃酮類的成分較多,是治療咳嗽、哮喘、痰多的主要活性成分,如杜鵑素、去甲杜鵑素、槲皮素等[4-5];此外還有文獻(xiàn)報(bào)道滿山紅還含有少量機(jī)酸類、萜類等成分[6-7];但目前關(guān)于滿山紅復(fù)雜化學(xué)成分的整體分析方法尚未見報(bào)道。UPLC-Q-TOF/MS技術(shù)通過查閱文獻(xiàn)構(gòu)建杜鵑屬植物一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫包括相對(duì)分子質(zhì)量、名稱結(jié)構(gòu)式等[8]可快速鑒定天然藥物中的化學(xué)成分,具有高分辨率、高靈敏度、專屬性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),常用于中藥材中的化學(xué)成分鑒定[9-10]。因此,本實(shí)驗(yàn)使用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析滿山紅中的化學(xué)成分。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥材 滿山紅于2021年9月采自黑龍江省大興安嶺,經(jīng)黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院霍金海研究員鑒定為杜鵑花科杜鵑花屬植物興安杜鵑RhododendrondauricumL.的干燥葉,放置于通風(fēng)處陰干7 d,粉碎成細(xì)粉用于樣品制備。

1.2 儀器與試劑 Tripe-TOF 5600+型的質(zhì)譜儀:美國AB SCEIX公司;ExionLCTM的液相色譜儀:美國AB SCEIX公司;XSR205DU型精密分析天平、ML104T型電子天平:上海梅特勒-托利多儀器有限公司;Analyst TF 1.6 software軟件、Peakview 2.0/masterview1.0 software軟件:美國AB SCEIX公司。試劑:甲酸乙腈為色譜純;甲醇為分析純;水為蒸餾水。

2 方法

2.1 供試品溶液制備 取本品細(xì)粉2 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇25 mL,稱定重量,超聲處理(功率250 W,頻率33 kHz)30 min,放冷,再稱定重量,甲醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。

2.2 色譜條件 色譜柱Acquity UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm);柱溫保持35 ℃;0.1%甲酸-水(流動(dòng)相A)-0.1%甲酸-乙腈(流動(dòng)相B);洗脫程序?yàn)?～4 min,5%～70%B;4～23 min,70%～100%B;23～23.10 min,100%～5%B;23.10～25.00 min,5%～5%B;設(shè)置流速為0.3 mL/min;進(jìn)樣量3 μL。

2.3 質(zhì)譜條件 正負(fù)離子模式下的電噴霧離子源;離子源電壓5 500 V、溫度550 ℃;霧化氣:輔助氣:氣簾氣為55 psi;55 psi;35 psi;Product Ion掃描范圍為50～1 500 Da。

2.4 數(shù)據(jù)分析 吸取供試品溶液,按照2.2、2.3 項(xiàng)下條件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集,用于數(shù)據(jù)分析。

2.4.1 目標(biāo)性篩查 查閱文獻(xiàn)構(gòu)建杜鵑屬植物一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫包括相對(duì)分子質(zhì)量、名稱結(jié)構(gòu)式等,使用peakview2.0軟件設(shè)置質(zhì)量數(shù)偏差小10 ppm,根據(jù)精確相對(duì)分子質(zhì)量、碎片離子峰等信息,對(duì)組分樣本進(jìn)行篩查。使用Natural products HR-MS/MS Spectral Library 1.0 software篩查,將化合物的二級(jí)質(zhì)譜信息與數(shù)據(jù)庫中對(duì)照品的二級(jí)譜圖信息進(jìn)行比對(duì)。

2.4.2 非目標(biāo)性篩查 將采集數(shù)據(jù)導(dǎo)入Marker View軟件,選擇母離子強(qiáng)度>3000 counts,S∶N>10 的所有色譜峰,依據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量,推測(cè)可能化學(xué)成分組成,再根據(jù)碎片離子峰以及文獻(xiàn)報(bào)道的裂解規(guī)律等信息,推斷化合物結(jié)構(gòu)。

3 結(jié)果

3.1 UPLC-Q-TOF/MS分析 中藥化學(xué)成分繁多復(fù)雜,采用單一模式不能整體研究其組成,故本實(shí)驗(yàn)按照色譜、質(zhì)譜條件對(duì)供試品溶液在正、負(fù)離子模式下進(jìn)行測(cè)定,總離子流圖見圖1。

圖1 滿山紅總離子流圖(A.正離子;B.負(fù)離子)

3.2 結(jié)構(gòu)鑒定 通過UPLC-Q-TOF/MS技術(shù)分析與鑒定,推斷滿山紅中60個(gè)化合物,包括25個(gè)黃酮類化合物、5個(gè)香豆素類化合物、7個(gè)有機(jī)酸類化合物、4個(gè)三萜類化合物、3個(gè)二萜類化合物、16個(gè)其他化合物,結(jié)果見表1。

表1 滿山紅結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果

3.3 化合物的質(zhì)譜裂解特征分析

3.3.1 黃酮類化合物的分析鑒定 黃酮類化合物是很多中藥材都含有的化學(xué)成分,他的質(zhì)譜裂解規(guī)律也在大量文獻(xiàn)中報(bào)道[11-13],實(shí)驗(yàn)共分析鑒定了25種黃酮類化合物,以36號(hào)化合物為例,ESI+模式下準(zhǔn)分子離子的質(zhì)荷比為m/z301[M+H]+,經(jīng)碰撞產(chǎn)生碎片離子m/z147[M+H-C8H8O-2OH]+,又經(jīng)碰撞產(chǎn)生碎片離子m/z107[M+H-C8H8O-C2H2O3]+,C環(huán)發(fā)生RDA裂解產(chǎn)生二級(jí)碎片離子m/z181[M+H-C8H8O]+和m/z119[M+H-C9H10O4]+,根據(jù)數(shù)據(jù)庫推斷化合物36為杜鵑素,該化合物的二級(jí)質(zhì)譜圖與標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)鏡像圖見圖2,可能的裂解方式見圖3。

圖2 杜鵑素二級(jí)質(zhì)譜圖

圖3 杜鵑素可能的裂解圖

3.3.2 香豆素類化合物的分析鑒定 研究表明香豆素類是滿山紅主要含有的一類化合物[14-15],本實(shí)驗(yàn)中共分析鑒定出5種香豆素類化合物,以50號(hào)化合物為例,ESI-模式下準(zhǔn)分子離子的質(zhì)荷比為m/z161[M-H]-,失去一分子CO2,產(chǎn)生碎片離子m/z117[M-H-CO2]-,失去一分子CO產(chǎn)生二級(jí)碎片離子m/z133[M-H-CO]-,經(jīng)碰撞,生成碎片離子m/z105[M-H-2CO]-。推斷其為7-羥基香豆素,該化合物的二級(jí)質(zhì)譜圖與標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)鏡像圖見圖4,可能的裂解方式見圖5。

圖4 7-羥基香豆素二級(jí)質(zhì)譜圖

圖5 7-羥基香豆素可能的裂解圖

3.3.3 有機(jī)酸類化合物的分析鑒定 有機(jī)酸類成分在中草藥的根、葉中廣泛分布,但滿山紅中有機(jī)酸類成分目前報(bào)道較少[16-17],本實(shí)驗(yàn)分析鑒定了7 種有機(jī)酸類化合物,以1號(hào)化合物為例,ESI-模式下準(zhǔn)分子離子的質(zhì)荷比為m/z191[M-H]-,脫去一分子H2O產(chǎn)生二級(jí)碎片離子m/z173[M-H-H2O]-,又脫去一個(gè)CH2O2產(chǎn)生碎片離子m/z127[M+H-H2O-CH2O2]-,脫去一分子H2O生成二級(jí)碎片離子,m/z109[M+H-2H2O-CH2O2]-。推斷化合物1為奎寧酸,該化合物的二級(jí)質(zhì)譜圖與標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)鏡像圖見圖6,可能的裂解方式見圖7。

圖6 奎寧酸二級(jí)質(zhì)譜圖

圖7 奎寧酸可能的裂解圖

4 討論

UPLC-Q-TOF/MS技術(shù)可以對(duì)中藥材的化學(xué)成分進(jìn)行系統(tǒng)定性分析,全面闡明其化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ),豐富藥材的化學(xué)成分信息[18],本實(shí)驗(yàn)為滿山紅質(zhì)量的評(píng)價(jià)以及含滿山紅的復(fù)方制劑研究奠定了基礎(chǔ)。

文獻(xiàn)報(bào)道黃酮類化合物是治療急慢性支氣管炎的關(guān)鍵性成分[19-20],從實(shí)驗(yàn)鑒定結(jié)果來看,滿山紅含有大量黃酮類成分;還含有杜鵑屬類少量的有毒性木藜蘆烷二萜類化合物,如木藜蘆毒素Ⅶ、帚天人菊素B。并在滿山紅中首次發(fā)現(xiàn)原莪述烯醇、去甲丁香色原酮等成分。本實(shí)驗(yàn)為杜鵑屬植物化學(xué)成分質(zhì)譜規(guī)律分析提供借鑒,對(duì)滿山紅資源的進(jìn)一步開發(fā)與利用具有指導(dǎo)意義。