劉 敏,余 樂,范 蕾,張曉芹,黃繩武,陳 夢,陳張金,陳琴鳴,陳桂云

(1麗水市質(zhì)量檢驗檢測研究院·浙江 麗水 323000;2麗水市中醫(yī)院·浙江 麗水 323000;3浙江中醫(yī)藥大學·浙江 杭州 310053)

樹參為五加科樹參屬樹參Dendropanaxdentiger(Harms) Merr.的灌木或喬木,用藥歷史悠久,具有祛風除濕、活血消腫的功效,可用于治療風濕病、關(guān)節(jié)炎、半身不遂等疾病,是我國江浙一帶民間使用頻率較高的30種畬藥之一[1-3],其藥用部位包括根、莖、皮,目前藥效物質(zhì)基礎研究的薄弱是制約樹參臨床推廣應用的關(guān)鍵因素之一?，F(xiàn)有研究表明,滑膜增生是人類風濕性關(guān)節(jié)炎病理過程中的一個重要特征[4],急、慢性滑膜炎癥也同樣存在于關(guān)節(jié)炎患者中,而滑膜成纖維細胞是血管翳交界處最常見的細胞類型,在類風濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[5]。為探究樹參抑制滑膜成纖維細胞異常增殖作用及其藥效物質(zhì)基礎,項目組制備了樹參主要藥用部位莖的純水、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇、不同濃度乙醇等溶劑提取物,對TNF-α誘導的HFLS-OA增殖抑制作用開展了研究,同時采用高效液相色譜法建立了上述提取物的指紋圖譜,采用偏最小二乘回歸法(PLSR)和灰色關(guān)聯(lián)度法(GRA)聯(lián)合分析色譜峰與抑制HFLS-OA異常增殖作用的關(guān)系,揭示了樹參莖抑制HFLS-OA異常增殖作用的藥效物質(zhì)基礎,在細胞水平上探討該畬藥抗炎的作用,為該品種進一步的開發(fā)應用奠定了基礎。

1 材料

1.1 細胞 HFLS-OA(3代):購自北京沿程科技有限公司。

1.2 藥品和試劑 樹參莖制備提取物用樣品由12批樣品等量混合而成,12批樣品經(jīng)李建良主任中藥師鑒定為五加科科植物樹參Dendropanaxdentiger。12批樣品具體信息見表1。紫丁香苷對照品(111574-201605,含量為95.2%)、綠原酸對照品(110753-201716,含量為99.3%)、蘆丁對照品(100080-201409,含量為91.9%)、異綠原酸A對照品(111782-201706,含量為97.3%):中國食品藥品檢定研究院;異綠原酸B對照品(102776,含量≥95%)、異綠原酸C對照品(102317,含量≥95%)、Saikolignanoside A對照品(103203,含量≥95%):江蘇永健醫(yī)藥科技有限公司;芥子醛葡萄糖苷對照品(DST210311-292,含量≥95%):德思特生物技術(shù)有限公司;松柏醇對照品(wkq20052602,含量≥98%):四川省維克奇生物科技有限公司。

表1 樹參莖樣品信息表

甲氨蝶呤注射液(MTX,批號:DL6898,規(guī)格:2 mL∶50mg):Pfizer(Perth)Pty Limited;TNF-α:南京金斯瑞生物科技有限公司;乙腈、甲酸、四氫呋喃為色譜純;氯仿、石油醚、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇為分析純;水為哇哈哈純凈水;高糖培養(yǎng)基(DMEM)、澳洲優(yōu)級胎牛血清(FBS)、二甲基亞砜(DMSO):美國Gibco公司;噻唑藍試劑(MTT):美國Amresco公司;雙抗(青霉素-鏈霉素100X):上海源培生物科技股份有限公司;胰蛋白酶(EDTA):吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司。

1.3 儀器 1260型高效液相色譜儀:美國安捷倫公司;XS105DU型電子天平:瑞士梅特勒公司;IX71型熒光倒置顯微鏡:奧林巴斯;MK3型酶標儀:賽默飛世爾科技公司;3111型二氧化碳培養(yǎng)箱:賽默飛世爾科技公司;TC20型細胞計數(shù)器:美國伯樂公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 不同提取物指紋圖譜的建立[6]

2.1.1 色譜條件 色譜柱為sunfire TM C18(4.6 mm×250 mm,5μm),流動相為乙腈(A)-混合水溶液(含甲酸為0.2%和四氫呋喃0.2%)(B),梯度洗脫:0～5 min,4%～9%A;5～35 min,9%～14%A;35～50 min,14%A;50～60 min,14%～20%A,60～80 min,20%～30% A。檢測波長為256 nm,柱溫30 ℃,體積流量為1.0 mL·mim-1,分析時間為80 min,進樣量為5μL。

2.1.2 供試品溶液的制備 取干燥過2 號篩樹參莖粉末(12批樣品等量混合)100 g,用10倍量純水加熱回流提取3次,每次2 h,合并提取液,減壓濃縮后置于減壓干燥箱內(nèi)烘干,即得水提取物(S1);稱取干燥過2號篩樹參莖粉末(12批樣品等量混合)5份,每份300 g,分別以8倍量20%、40%、60%、80%、100%乙醇為溶劑加熱回流提取3次,每次2 h,合并提取液,減壓濃縮至無醇味,置于減壓干燥箱內(nèi)烘干,即得相應濃度乙醇提取物(分別為S2～S6);80%乙醇提取后的藥材粉末加入10倍量的純水,加熱回流提取3次,每次2 h,合并提取液,減壓濃縮后置于減壓干燥箱內(nèi)烘干,即得醇提后水提取物(S8);稱取80%乙醇提取物5 g混懸于50 mL水中,轉(zhuǎn)移到分液漏斗中,依次加入氯仿、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取,各重復3次,分別收集萃取所得成分至蒸發(fā)皿中減壓干燥得相應溶劑提取物(分別為S9、S10、S11、S7)。稱取上述相當于原藥材5 g的提取物,用提取溶劑溶解并定容至5 mL容量瓶中,過濾,即得供試品溶液。

2.1.3 對照溶液的制備 分別精密稱取標準物質(zhì)適量至10 mL容量瓶中,加甲醇溶解并定容制成每1 mL含紫丁香苷為618.0 mg·L-1、綠原酸621.0 mg·L-1、芥子醛葡萄糖苷361.0 mg·L-1、松柏醇579.0 mg· L-1、Saikolignanoside A 400.0 mg·L-1、蘆丁402.7 mg·L-1、異綠原酸A 554.0 mg·L-1、異綠原酸B 572.0 mg· L-1、異綠原酸C 506.0 mg·L-1的標準物質(zhì)儲備液。再分別精密移取上述標準物質(zhì)儲備溶液1.5、1、0.5、0.2、0.2、0.2、1、1、1 mL于同一15 mL容量瓶中,加甲醇定容至刻度即得混合對照品溶液。

2.1.4 方法學考察 以提取最費時的正丁醇提取物為考察樣品,以分離度較好、保留時間適中的綠原酸為參照,進行精密度、重復性、穩(wěn)定性考察。

2.1.4.1 精密度考察 取按“2.1.2”項下方法制備的正丁醇提取物供試品溶液,連續(xù)進樣6次,記錄色譜圖,相對保留時間的RSD為0.07%～0.23%,相對峰面積的RSD為0.15%～2.96%,結(jié)果表明各共有指紋峰的相對保留時間和相對峰面積基本一致,測定結(jié)果精密度較好。

2.1.4.2 重復性試驗 按“2.1.2”項下的方法同時制備6份正丁醇提取物供試品溶液,分別進樣,記錄色譜圖,相對保留時間的RSD范圍為0.07%～0.27%,相對峰面積的RSD范圍為1.85%～4.67%,結(jié)果表明重復性較好。

2.1.4.3 穩(wěn)定性試驗 取按“2.1.2”項下方法制備正丁醇提取物供試品溶液,分別在0、2、6、12、24、48 h進樣,記錄色譜圖,相對保留時間的RSD范圍為0.06%～0.41%,相對峰面積的RSD范圍為0.62%～2.91%。結(jié)果表明樣品在48 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.1.5 供試品的測定 取供試品溶液5 μL,按“2.1.1”項下條件進樣分析,比較11 個提取部位的色譜峰,確定34 個明顯特征峰,記錄相應峰面積,根據(jù)樹參莖化學成分鑒定結(jié)果,采用對照品比對法對9個成分進行了指認,結(jié)果見圖1～圖2。

S1.水提取物; S2.20%乙醇提取物; S3.40%乙醇提取物; S4.60%乙醇提取物; S5.80%乙醇提取物; S6.100%乙醇提取物;S7.正丁醇提取物;S8.醇提后水提取物; S9.氯仿提取物; S10.乙醚提取物; S11.乙酸乙酯提取物

11.紫丁香苷;17.綠原酸;22.芥子醛葡萄糖苷;23.松柏醇;27.Saikolignanoside A;28.蘆丁;32.3,4-O-二咖啡?；鼘幩? 33.3,5-O-二咖啡酰基奎寧酸;34.4,5-O-二咖啡?；鼘幩?/p>

2.2 不同提取物對HFLS-OA異常增殖的抑制作用[7]

2.2.1 細胞培養(yǎng) HFLS-OA細胞放入含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基中,置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng),待細胞長至80%～90%時進行傳代,接種于培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中進行培養(yǎng)。

2.2.2 造模及分組 用TNF-α刺激HFLS-OA細胞造模。將細胞分為空白組(DMEM培養(yǎng)液),模型組(加入終質(zhì)量濃度為10μg·L-1的TNF-α溶液);陽性甲氨蝶呤組(MTX,加入終質(zhì)量濃度為20 mg·L-1與10 μg·L-1TNF-α溶液的混合溶液);樹參莖不同提取物組(S1～S11,加入終質(zhì)量濃度為31.25 g·L-1的提取物溶液與10 μg·L-1TNF-α溶液的混合溶液)。

2.2.3 細胞增殖抑制實驗 采用MTT法測定細胞增殖活性。取對數(shù)生長期細胞,用含0.25%EDTA的胰酶消化,800 r·min-1離心5 min后,接種于96孔培養(yǎng)板中,每孔100 μL。用一次性吸管吹打混勻成單細胞懸液,置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞融合80%后按“2.2.2”項下的分組給藥。每孔100 μL,每個濃度設置6個復孔,培養(yǎng)24 h后,每孔加入MTT溶液20μL,37 ℃孵育4 h后,采用酶標儀于490 nm處測定各孔吸光度值(A),計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率(%)=(TNF-α模型組A值-藥物組A值)/TNF-α模型組A值×100%,重復3 次。

2.2.5 細胞增殖抑制實驗結(jié)果 與空白組比較,TNF-α模型組細胞明顯增殖(P<0.01);與模型組比較,除S8醇提后水提取物外,各給藥組細胞的增殖均收到明顯抑制(P<0.05);樹參莖各提取物相對20 mg· L-1陽性MTX組均有顯著性差異,S1、S2、S3、S4、S7的HFLS-OA增殖抑制率較高,范圍為41.9%～42.9%,且相互之間無顯著性差異;同等條件下,次之的是S5、S6、S9、S10,HFLS-OA增殖抑制率范圍為37.8%～39.6%,S11的HFLS-OA增殖抑制率為32.3%,S8則無明顯抑制作用。結(jié)果見圖3。

注:與MTX組比較,#P<0.05,##P<0.01

2.3 樹參莖抑制HFLS-OA異常增殖作用譜效關(guān)系的建立[6-10]

2.3.1 PLSR法 將指紋圖譜各色譜峰的峰面積作為自變量,細胞增殖抑制率作為因變量,采用Simca-P 14.1軟件對其進行偏最小二乘回歸分析,數(shù)據(jù)選擇標準差標準化處理,消除變量量綱差異,計算得到34個特征峰與抑制率的標準化回歸系數(shù)(圖4-A)和VIP值(圖4-B)。VIP>1時,自變量在解釋因變量時具有重要意義。由圖4可知,峰34、21、22、17、11、27、7、13、24、8、4、31、14、9、33、29、16、3、10的VIP值均大于1(按VIP值從大到小排列),并且其回歸系數(shù)均為正相關(guān),說明這些峰號對應的物質(zhì)對于抑制HFLS-OA異常增殖有重要影響。

圖4 樹參莖提取物PLSR標準化回歸系數(shù)圖(A)和藥效的VIP貢獻圖(B)

2.3.2 GRA法 將細胞增殖抑制率作為參考序列,指紋圖譜各色譜峰的峰面積作為比較序列,采用均值變化法進行無量綱化處理,分別計算每個比較序列和參考序列所對應的關(guān)聯(lián)系數(shù),再取序列平均值,得到34個峰對抑制率的灰色關(guān)聯(lián)度(r)。關(guān)聯(lián)度越大,說明該物質(zhì)對藥效的影響越大,除峰12、26外,其他峰的r值均大于0.8,其中貢獻最大、r≥0.9的前7個峰分別為34、17、11、7、24、33、27。

表2 關(guān)聯(lián)度結(jié)果

2.3.3 PLSR和GRA聯(lián)合比較 將VIP>1和r≥0.9的色譜峰整合,得到重疊的色譜峰,與抑制作用相關(guān)性由高到低順序為峰34>17>11>7>24>33>27,說明這些峰號對應的成分對于樹參莖抑制HFLS-OA異常增殖有重要影響。

3 討論

3.1 在前期的研究中采用LC-MS聯(lián)用、NMR法對樹參莖中所含的化合物進行了分析,共分離鑒定出10個化合物,分別是綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、Saikolignanoside A等酚酸成分,蘆丁、山柰酚-3-O-蕓香糖苷等黃酮類成分,紫丁香苷、松柏醇、芥子醛葡萄糖苷等苯丙素類化合物,其中異綠原酸C、綠原酸、紫丁香苷、異綠原酸A含量較高,而山柰酚-3-O-蕓香糖苷含量極低,高效液相色譜法難以鑒別,故在建立樹參莖不同提取物指紋圖譜時,未將其作為特征性色譜峰;此外,采用DAD檢測器對比了未知成分的色譜峰,結(jié)果發(fā)現(xiàn)峰11和12,峰18和19的出峰時間接近,但是各色譜峰的紫外吸收完全不同,其中峰19為樹參莖氯仿提取物、乙醚提取物的特有成分;峰12為乙醚提取物的特有成分;另外,峰26也為樹參莖乙醚提取物的特有成分。

3.2 在前期的預試驗中,考察了1.95、3.90、7.81、15.62、31.25、62.50、125 g·L-1的樹參莖不同濃度提取物(按生藥量算)對HFLS-OA細胞增殖的影響。結(jié)果,當樹參莖提取物濃度低于3.90 g·L-1時,其對HFLS-OA細胞增殖無明顯影響;當樹參莖提取物濃度高于31.25 g·L-1時,其對HFLS-OA細胞增殖有抑制作用;當給藥濃度在3.90～31.25 g·L-1時,其對細胞的增殖抑制率具有濃度依賴性,當給藥濃度為31.25 g·L-1時抑制率最高可達42.9%,故選擇該濃度作為樹參莖構(gòu)建譜效關(guān)系的給藥濃度。結(jié)果表明,在該濃度下,除了樹參莖醇提后水提取物外,其他10個提取物均有一定的抑制HFLS-OA異常增殖作用,其中樹參莖20%、40%、60%乙醇提取物、正丁醇提取物、水提取物的HFLS-OA增殖抑制率較高,且無顯著性差異。研究結(jié)果同時表明樹參莖可通過抑制HFLS-OA異常增殖而發(fā)揮抗炎作用,為后續(xù)抗炎機制的研究奠定了基礎。

3.3 常用的相關(guān)性分析方法包括GRA法、PLSR法,其中GRA法具有多目標性、整體性、模糊性等性質(zhì),但無法描述相關(guān)方向;PLSR法能最大限度地利用數(shù)據(jù)信息,體現(xiàn)各成分對藥效指標的綜合作用,但只能給出自變量與因變量之間抽象的結(jié)構(gòu)關(guān)系,而無法精確地定量。故在構(gòu)建譜效關(guān)系時采用了兩者分析方法,以期相互佐證,從整體上評價各化學成分與藥效指標的相關(guān)性大小、變化方向及顯著程度。分析結(jié)果表明,樹參莖抑制HFLS-OA異常增殖的作用是化學成分群共同作用的結(jié)果,其中峰34(異綠原酸C)、17(綠原酸)、11(紫丁香苷)、7(未知成分)、24(未知成分)、33(異綠原酸A)、27(Saikolignanoside A)是樹參莖抑制HFLS-OA異常增殖的主要藥效成分。