李夢雪,孫國東,李玉姍,劉曉東,霍金海,王偉明

(黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院·黑龍江 哈爾濱 150036)

密蒙花為馬錢科植物密蒙花BuddlejaofficinalisMaxim.的干燥花蕾和花序[1]343,是傳統(tǒng)的眼科用藥。藥用始見于《開寶本草》,謂其“主青盲膚翳,赤澀多眵淚,消目中赤脈,小兒麩痘及疳氣攻眼”。密蒙花主要分布于我國陜西、甘肅、云南、貴州以及華中和華南等地區(qū)?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)密蒙花具有抑菌抗炎、抗氧化、醛糖還原酶抑制等多種藥理活性[2]。降香是豆科植物降香檀DalbergiaodoriferaT.Chen的樹干以及根的干燥心材[1]240。藥用始載于唐末李珣的《海藥本草》[3]。主要分布在海南、兩廣及福建等地區(qū)?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)其具有擴(kuò)血管、調(diào)血脂、降血壓、抗血栓、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗氧化等作用[4-5]。

研究表明密蒙花中含有黃酮類化合物、苯乙醇苷類、萜類、揮發(fā)油等多種化學(xué)成分。主要以黃酮和苯乙醇類為主要代表[6]。目前已從密蒙花中分離得到以蒙花苷為代表的28種黃酮類化合物以及35種苯乙醇苷類化合物,如毛蕊花糖苷、紅景天苷、松果菊苷、地黃苷、紫丁香苷等[6-7];賀銀菊[8]從其花蕾中揮發(fā)油中共鑒定出 26 個成分,其中酯類成分含量最高,其次是醇、酮等成分。研究表明降香化學(xué)成為極為復(fù)雜,主要包含揮發(fā)油類、倍半萜類、黃酮類、桂皮酰酚類及其他成分[9];其中黃酮類化合物已鑒別出122種,集中于黃酮類、二氫黃酮類、異黃酮類、異黃烷類、二氫異黃酮類、新黃酮類。

本院中藥所采用提取純化后的降香、密蒙花提取物作為自制防曬乳劑的主要防曬成分,運用超高效液相-四級桿串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)快速、準(zhǔn)確地對中藥防曬乳進(jìn)行成分分析,推斷其化學(xué)結(jié)構(gòu),為中藥防曬乳藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、質(zhì)量控制的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

中藥防曬乳:實驗室自制,以密蒙花、降香為原料經(jīng)提取分離、純化、冷凍干燥后作為防曬主要成分,經(jīng)O/W法制備成乳劑。

AB Sciex ExionLC AD超高效液相色譜儀:Sciex,美國;AB SCIEX Triple-TOFTM5600+質(zhì)譜儀:Sciex,USA;KQ-300DB型數(shù)控超聲波清洗器:昆山市超聲儀器有限公司;BSA224S-CW型電子天平:Sartorius,Germany;FD-1D-80+冷凍干燥機:北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司;AB SCIEX Triple-TOFTM5600質(zhì)譜儀:美國賽克斯公司。

甲醇(分析純):西隴科學(xué)股份有限公司;乙腈(色譜純):德國Merck公司;甲酸(色譜純):美國Fisher公司;蒸餾水:廣州屈臣氏食品飲料有限公司。

2 方法

2.1 供試品溶液的制備 稱取中藥防曬乳0.5 g,精密稱定,置具塞刻度離心管中,精密加入3 mL飽和氯化鈉溶液,密塞,用力振搖使分散均勻后,加入8 mL乙腈,超聲處理(功率300 W,頻率100 kHz)20 min,于4 ℃下以10 000 r/min離心10 min,再次精密加入2 mL乙腈,搖勻,吸上清液用0.22 μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液,作為供試品溶液。

2.2 色譜條件 Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm),AQUITYUPL-CBEH C18VanGuard Pre-Column預(yù)柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm),柱溫為40 ℃,流動相為0.1%甲酸溶液(A)-0.1%甲酸乙腈(B),梯度洗脫(0～2 min,5%～70%B;2～22 min,70%～100%B,保持1 min;23～23.1 min,100%～5%B,保持2 min),流速為0.3 mL/min,進(jìn)樣量為5 μL。

2.3 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源(ESI),離子化模式為電噴霧正、負(fù)離子模式,離子噴霧電壓ESI+/ESI-為5 500 V/-4 500 V;離子源溫度為550 ℃,DP為80/-80 V,CE為35e V/-35e V,CES為15e V。霧化氣體為N2,霧化氣Gas1為379.2 kPa,霧化輔助氣Gas2為379.2 kPa,氣簾氣Cur Gas為241.3 kPa。TOF MS掃描范圍為80～1 500 DA,IDA設(shè)置響應(yīng)值超過100 cps的8個最高峰進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描,Product Ion掃描范圍為50～1 500 DA,開啟動態(tài)背景扣除(DBS)。數(shù)據(jù)采集軟件為Analyst TF 1.6 software;數(shù)據(jù)處理軟件系統(tǒng)為Peakview 2.0/ masterview 1.0 software。

2.4 數(shù)據(jù)分析 通過查閱密蒙花、降香國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn),結(jié)合 TCMSP 數(shù)據(jù)庫將中藥防曬乳中密蒙花、降香藥材化學(xué)成分信息進(jìn)行匯總,包括中文或英文名稱、分子式、結(jié)構(gòu)式、相對分子質(zhì)量、成分類型、CAS號等,形成的一個包含152 種化合物的一級質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫。將采集的正、負(fù)離子數(shù)據(jù)導(dǎo)入Peakview 2.0,進(jìn)行目標(biāo)篩查,選擇相對分子質(zhì)量的理論值與實際值誤差在1.0×10-5范圍內(nèi)的化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)推斷。推測各色譜峰對應(yīng)化合物的分子式;使用 Natural Products HR-MS/MS Spectral Library 1.0 Software(USA AB SCIEX)進(jìn)行目標(biāo)篩查,該數(shù)據(jù)中對照品的二級譜圖信息與樣品中的化合物進(jìn)行自動匹配,確認(rèn)推斷成分。

3 結(jié)果

3.1 UPLC-Q-TOF/MS分析 經(jīng)過色譜條件優(yōu)化,按“2.2”及“2.3”項下條件進(jìn)行分析,供試品溶液在正、負(fù)離子模式下的色譜圖均得到了良好的分離效果及離子化效率,其BPC圖見圖1,化學(xué)成分見表1。

表1 基于UPLC-Q-TOF/MS技術(shù)分析中藥防曬乳的化學(xué)成分

圖1 中藥防曬乳化學(xué)成分總離子流圖

3.2 化合物的質(zhì)譜裂解特征分析

3.2.1 黃酮類化合物的分析鑒定 黃酮類化合物是密蒙花和降香中的特征性成分,本研究中共分析鑒別了31個黃酮類化合物。以化合物2(降香成分)為例,根據(jù)元素組成分析該化合物分子式為C15H12O4,tR為6.8 min,二級質(zhì)譜圖見圖2,ESI+模式下檢測到準(zhǔn)分子離子為m/z 257[M+H]+,質(zhì)譜圖中存在的豐度最高的137[M+H-C8H8O]+碎片離子為黃酮類成分標(biāo)志碎片,此碎片提示A環(huán)僅存在一個羥基,準(zhǔn)分子離子優(yōu)先脫去羥基產(chǎn)生239[M+H-H2O]+碎片離子,根據(jù)137碎片離子的提示,且239碎片離子的豐度較小,因此推斷此化合物的另一個羥基位于B環(huán)的4’位,此碎片連續(xù)脫去羰基及B環(huán)產(chǎn)生211[M+H-H2O-CO]+及147[M+H-H2O-CO-C5H4]+碎片離子,最后在脫去一分子羰基后產(chǎn)生119[M+H-H2O-2CO-C5H4]+碎片離子,對照數(shù)據(jù)庫并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[10]以及裂解碎片特征判斷該化合物可能甘草素,可能的裂解方式見圖3。

圖2 化合物2的二級質(zhì)譜圖

圖3 化合物2可能的裂解路線

化合物8分子式為C16H12O5,二級質(zhì)譜圖見圖4。ESI+模式下檢測到準(zhǔn)分子離子為m/z 285[M+H]+,此碎片丟失15Da產(chǎn)生270碎片,提示結(jié)構(gòu)中存在甲氧基,此碎片繼續(xù)丟失一分子水及兩分子CO中性碎片并發(fā)生重排后產(chǎn)生253[M+H-H2O]+、225[M+H-H2O-CO]+及197[M+H-H2O-2CO]+三個碎片離子,而也可以直接丟失C2O產(chǎn)生213碎片離子,而137[M+H-C9H8O2]+碎片離子的存在提示了A環(huán)中僅存在一個羥基,對照數(shù)據(jù)庫并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)以及裂解碎片特征判斷該化合物可能為毛蕊異黃酮,可能的裂解方式見圖5。

圖4 化合物8的二級質(zhì)譜圖

圖5 化合物8可能的裂解路線

3.2.2 苯乙醇苷類化合物的分析鑒定 苯乙醇苷類化合物是密蒙花中的另一大特征性成分,在本次研究中共分析鑒別了4個苯乙醇苷類化合物;以化合物45(密蒙花成分)為例,根據(jù)元素組成分析該化合物分子式為C29H36O15,tR為4.5 min,二級質(zhì)譜圖見圖6,ESI-模式下準(zhǔn)分子離子的質(zhì)荷比為m/z 623[M-H]-,脫掉端基的基團(tuán)后得到碎片離子m/z 461[M-H-C9H6O3]-及端基中性碎片133[M-H-C21H30O13]-,再脫掉一個糖基得到碎片離子m/z 315[M+H-C9H6O3-C6H10O4]-,此碎片提示此結(jié)構(gòu)為鼠李糖基團(tuán)的存在,而此碎片繼續(xù)將端基脫去得到葡萄糖中性碎片179、161及113碎片離子,對照數(shù)據(jù)庫并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[11]以及裂解碎片特征判斷該化合物可能為毛蕊花糖苷,可能的裂解方式見圖7。

圖6 化合物45的二級質(zhì)譜圖

圖7 化合物45可能的裂解路線

化合物47分子式為C34H44O19,ESI-模式下檢測到準(zhǔn)分子離子為m/z755[M-H]-,直接丟失C6H10O5產(chǎn)生593[M-H-C6H10O5]-碎片,此碎片繼續(xù)丟失C5H8O4后得到461[M-H-C6H10O5-C5H8O4]-碎片,也可直接丟失端基的C9H8O3得到429[M-H-C6H10O5-C5H8O4-C9H8O3]-碎片,對照數(shù)據(jù)庫并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)以及裂解碎片特征判斷該化合物可能為連翹酯苷B,可能的裂解方式見圖9。

圖8 化合物47的二級質(zhì)譜圖

圖9 化合物47可能的裂解路線

4 討論

經(jīng)過前期試驗研究證實降香、密蒙花乙醇提取物在UVB和UVA區(qū)具有良好的紫外吸收能力,經(jīng)過分離純化后,作為中藥防曬乳劑的主要成分,具有良好的防曬作用[12]。

為了進(jìn)一步從成分上探究防曬乳劑發(fā)揮防曬和抗氧化作用的原理。本次研究采用UPLC-Q-TOF/MS聯(lián)用技術(shù)對中藥防曬乳劑進(jìn)行化學(xué)成分分析。優(yōu)化了提取溶劑和提取方式,確定以乙腈作為提取溶劑,超聲30 min的條件下獲得的化合物最多。共推斷出48個化合物,包括31個黃酮類化合物、4個苯乙醇苷類成分、3個萜類成分、2個木脂素類成分、2個醌類成分、2個苯丙素類成分、2個其他化合物。為密蒙花、降香藥材的進(jìn)一步深入研究奠定了一定基礎(chǔ),也為中藥防曬乳的質(zhì)量控制和未知物的定性篩查提供理論參考和技術(shù)支持,為化妝品的質(zhì)量安全提供保障。

本實驗建立了中藥防曬乳的 UPLC-QTOF-MS /MS 高效快速分析的方法,全面地分析了其包含的化學(xué)成分,分離效果更好,檢測更全面,利于更多化合物檢出。結(jié)合 Peakview1.2 軟件進(jìn)行精確相對分子質(zhì)量篩選分析,通過比較一級精確荷質(zhì)比結(jié)合二級質(zhì)譜掃描得到具有較高準(zhǔn)確率和分辨率的質(zhì)譜圖,獲得更多準(zhǔn)確的碎片信息;結(jié)合質(zhì)譜裂解規(guī)律、化學(xué)對照品質(zhì)譜信息、相關(guān)文獻(xiàn)資料等,對中藥防曬乳中可能存在的功效性成分進(jìn)行了驗證。

本研究獲得的化學(xué)成分中大多集中于黃酮類成分和苯乙醇苷類成分,黃酮類化合物是在200～400 nm區(qū)域內(nèi)存在兩個主要的紫外吸收帶,具有較強的紫外吸收能力。本實驗獲得的蘆丁、蒙花苷等黃酮類成分是本研究制得的中藥防曬乳劑主要成分,是其具有吸收紫外線的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。通過吸收紫外線的光能轉(zhuǎn)化為熱能和無害的光放射出來,有效阻止紫外線對皮膚的損傷。

經(jīng)化學(xué)成分鑒定和文獻(xiàn)研究證實制備的中藥防曬乳劑除具有吸收紫外線的特征,多種成分還具有抗氧化和抗炎作用,可以起到預(yù)防光老化和改善皮膚炎癥的作用。本研究為中藥抗氧化和抗炎成分的檢測和具有開發(fā)價值活性成分的發(fā)現(xiàn)提供了一種新方法。