苑天彤,姜 雪,李 雪,王宏楊

(1黑龍江省中醫(yī)醫(yī)院南崗分院·黑龍江 哈爾濱 150001;2黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)· 黑龍江 哈爾濱 150040)

中藥何首烏主要藥效成份以 2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D 葡糖苷 (簡稱二苯乙烯苷,2,3,5,4′-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside,TSG)作為其定量指標(biāo)[1-2]。研究顯示TSG具有抗氧化作用,且不伴肝毒性[3-4]。本課題組的前期工作亦提示,TSG 通過干預(yù)DN大鼠腎組織 NO-ONOO-氧化途徑,明顯減少微量蛋白尿,減輕腎小管損傷,對腎臟早期損傷有保護(hù)作用[5-8]。本實驗探討了TSG 對中晚期 DN 大鼠腎臟保護(hù)作用及機制。

1 材料

1.1 實驗動物 健康8周齡SPF級雄性Wistar大鼠40只,體質(zhì)量(180±20)g,購自哈爾濱市松北區(qū)翔林養(yǎng)殖場,合格證號:SCXK(黑)2013-001,大鼠分籠飼養(yǎng),每籠5只。自由進(jìn)水、進(jìn)食。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。

1.2 藥品和試劑 二苯乙烯苷(TSG):中國科學(xué)院成都生物研究所研制,純度:99.44%,產(chǎn)品批號:MUST-18051611。鏈脲佐菌素(STZ):Sigma公司,貨號:S0130。血肌酐測量試劑盒:南京建成生物研究所。Rabbit Anti-VWF、聚合HRP標(biāo)記抗兔IgG:武漢博士德生物有限公司。Trizol Reagent、PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Erase、TB Green Premix Ex Taq II:TAKARA。

1.3 主要實驗儀器 羅康全血糖儀:德國羅氏診斷技術(shù)有限公司;LD5-2A型低速離心機:北京京立離心機有限公司;325病理切片機:德國Zeiss公司;Boxun電熱鼓風(fēng)干燥箱:上海博訊醫(yī)療生物儀器有限公司;YT-6C生物組織攤考片機:MDF-382E-80℃冰箱:日本SANYO公司;CFX96Real-time PCR儀:Bio-Rad。

2 實驗方法

2.1 動物造模與分組給藥 雄性 Wistar 大鼠40 只,隨機分為2 組:正常對照組10只,余 30 只高糖高脂飼料(普通飼料78.8%、膽固醇1%、牛膽鹽0.2%、蛋黃粉10%、豬油10%)喂養(yǎng) 8 周, 30 mg/kg STZ 尾靜脈注射(臨用前用 0.1mol/L、 pH 4.4 已配制的枸櫞酸緩沖液溶解,濃度 2%)。注射 STZ 72 h 后,大鼠尾靜脈取血檢測血糖,連續(xù)3 d非空腹血糖≥16.7 mmol/L 為 DM大鼠模型成功[9]。30只大鼠24只成模,隨機分為DN 組12只、TSG組12只。TSG組大鼠每天腹腔注射濃度1%的TSG溶液(30 mg/kg溶于生理鹽水)8周,正常組、模型組腹腔注射等量生理鹽水。實驗觀察20周,正常組大鼠死亡1只,模型組、TSG組大鼠均死亡4只。

2.2 觀察指標(biāo)及檢測

2.2.1 尿UALB/UCr、血SCr測定 實驗20 周末,用代謝籠收集24 h 尿液,散色比濁發(fā)測定UALB、UCr,計算UALB/UCr。末次給藥后禁食水12 h,用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉,腹主動脈采血,離心,分離血清,生化分析儀檢測GLU、SCr。

2.2.2 腎組織vWF表達(dá)的免疫組化檢測 腹主動脈采血后處死大鼠,取腎組織放10%的甲醛固定液中用于免疫組化的檢測;應(yīng)用Image-pro plus6.0病理圖像分析系統(tǒng)對陽性表達(dá)定量分析,每組每只大鼠腎臟組織標(biāo)本隨機抽取5個高倍鏡下視野(×400),棕黃色顆粒為陽性表達(dá),以光密度(IOD)代表蛋白的表達(dá)量。IOD=陽性的面積×平均的光密度,并取其均值作為該片子的相對表達(dá)量。

2.2.3 腎組織SUR2B/Kir6.1mRNA表達(dá)的Real-Time PCR測定 取腎臟組織加入1 mL Trizol 按試劑盒說明提取RNA。 cDNA的合成根據(jù)primeScriptTMRT Master Mix 要求操作。取1μLRNA溶液在PCR儀器上70 ℃溫度下孵育5 min,靜置在冰盒上冷卻;在溶液中加逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系并使其混合均勻,PCR儀上與37 ℃反應(yīng)15 min,然后85 ℃反應(yīng)10 s,迅速將其降溫至4 ℃,將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,-80 ℃冰箱中保存以備使用。qPCR:測量cDNA的濃度,將其定量為100 mg/L在1.5 mL的離心管中將其配置成n+1個混合體系。如下:取0.2 mL的PCR管,按照19μL將其每個分裝,分別加入cDNA的模板1μL,瞬時進(jìn)行離心后將其輕搖混勻,然后瞬時將其離心。將QPCR儀器設(shè)置好,開始PCR擴增(95 ℃,10 s;95℃,5 s,40 cycles;55 ℃,10 s,40 cycles;72 ℃,15 s,40 cycles;4 ℃,+∞)。引物序列見表1。以GAPDH為內(nèi)參,整理并將數(shù)據(jù)導(dǎo)出。

表1 PCR引物序列

3 實驗結(jié)果

3.1 實驗第20 周各組大鼠UALB/UCr、SCr比較 見表2。

表2 實驗第20周各組大鼠UALB/UCr、SCr比較

3.2 實驗第20 周各組大鼠腎組織vWF表達(dá)比較 見圖1,表3。

圖1 各組大鼠實驗第20 周腎組織vWF表達(dá)的免疫組化測定(×400)

表3 實驗第20周各組大鼠腎組織vWF表達(dá)比較

3.3 實驗第20 周各組大鼠腎組織SUR2B/Kir6.1mRNA表達(dá)的RT-PCR檢測結(jié)果 見表4。

表4 實驗第20周各組大鼠腎組織SUR2B mRNA、Kri6.1 mRNA表達(dá)比較

4 討論

眾所周知高血糖導(dǎo)致的代謝紊亂、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等引起血管內(nèi)皮細(xì)胞受損,內(nèi)皮細(xì)胞合成的血管性血友病因子(von Willebrand Factor,vWF),在血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷時釋放入血,主要介導(dǎo)血小板與血管內(nèi)皮黏附,促進(jìn)血栓形成,引起血流動力學(xué)異常,血流動力學(xué)異常是DN進(jìn)展至終末期腎病的重要機制[10]。ATP敏感性鉀離子通道(ATP-sensitive K+ channels,KATP)是由內(nèi)向整流亞基(Kir)和調(diào)節(jié)性磺脲受體(sulfony urea receptor,SUR)組合而成的八聚體,SUR可感受細(xì)胞內(nèi)ATP/ADP 濃度的變化,進(jìn)而通過KATP通道開放或關(guān)閉,調(diào)整NO生成和釋放,緩解血液動力學(xué)異常,改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂。腎臟存在不同的KATP通道,且KATP通道在腎臟生理調(diào)節(jié)過程中,對維持鉀離子的穩(wěn)態(tài)和腎臟微血管張力起著重要作用[11]。在病理狀態(tài)下,KATP結(jié)構(gòu)和功能的改變與腎功能的改變密切相關(guān)[12-13]。本實驗結(jié)果顯示,與模型組相比,TSG 組腎組織vWF 表達(dá)減弱、SUR2B/Kir6.1mRNA表達(dá)量增加,提示TSG可能通過干預(yù)ATP敏感性鉀離子通道SUR2B/Kir6.1亞型基因水平上的表達(dá),改善血流動力學(xué)異常,保護(hù)腎臟血管內(nèi)皮,延緩DN進(jìn)程。