王永軍,代曉微,嚴(yán)福軍

(1紹興第二醫(yī)院·浙江 紹興 312000;2吉林大學(xué)第二醫(yī)院·吉林 長春 130041;3江西瑞昌市婦幼保健院· 江西 九江 332200)

馬鬃蛇中含有多種氨基酸和微量元素,其在滋補(bǔ)強(qiáng)壯和祛風(fēng)活血中有顯著療效,在民間常用于治療血虛體弱和腎虛腰痛等病癥[1]?，F(xiàn)代研究表明,馬鬃蛇對(duì)雙相激素樣小鼠的療效顯著[2]。馬鬃蛇石油醚提取物(CVPEE)對(duì)ED大鼠的作用機(jī)制目前尚未見研究報(bào)道。有研究顯示,細(xì)胞凋亡在維持陰莖海綿體細(xì)胞數(shù)量及功能方面發(fā)揮重要作用,貫穿動(dòng)脈性勃起功能障礙發(fā)病的始末[3]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),動(dòng)脈性勃起功能障礙大鼠勃起功能差,陰莖細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯高于正常大鼠[4]。Caspase家族與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切,其中位于凋亡通路下游的效應(yīng)蛋白caspase-1起著關(guān)鍵作用,被認(rèn)為是凋亡最可靠的指標(biāo)[5]。本研究旨探究CVPEE通過調(diào)控Caspase-1對(duì)動(dòng)脈性ED大鼠勃起功能及生育功能影響。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年雄性健康SD大鼠50只,體質(zhì)量為220～240 g,均購自廣州因明生物醫(yī)藥科技有限公司,許可證號(hào)SYXK(粵)2022-2027,經(jīng)交配實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證所有大鼠均有正常的勃起功能。

1.2 藥物 馬鬃蛇購自南京市郊;馬鬃蛇石油醚提取物(CVPEE):本院研制,先將馬鬃蛇的內(nèi)臟取出并烘干,碾碎組織用乙醇醇滲漉提取石油醚萃取,將得到的干膏于冰箱保存。萬艾可:輝瑞制藥有限公司,國藥準(zhǔn)字H20020528。

1.3 試劑與儀器 阿樸嗎啡(Apomorphine, APO)、Caspase-1、Bax、Bcl-2抗體:武漢博士德生物工程有限公司;熒光定量PCR試劑盒:Invitrogen公司;TUNEL檢測試劑盒:上海碧云天生物技術(shù)有限公司;裂解緩沖液:美國Rockford公司。NE910顯微鏡:上海光密公司;PVDF 膜:美國Millipore公司。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組和模型制備 50 只大鼠適應(yīng)飼養(yǎng)3 d,隨機(jī)分為假手術(shù)組10只和造模組40只。1%戊巴比妥鈉(25 mg/kg)麻醉大鼠并沿大鼠腹部正中切開,充分暴露髂內(nèi)動(dòng)脈,用絲線結(jié)扎髂內(nèi)動(dòng)脈,縫合皮膚。假手術(shù)組大鼠只暴露髂內(nèi)動(dòng)脈,不結(jié)扎。在造模過程中造模組有2只大鼠造模失敗,予以補(bǔ)充后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將成模大鼠隨機(jī)分為模型組(灌胃等量生理鹽水)、CVPEE低劑量組(2 g/kg)、高劑量組(4 g/kg)和陽性對(duì)照組(萬艾可,12 mg/kg),每組10只;各組大鼠均灌胃給藥,1次/天,連續(xù)給藥21 d。

2.2 觀察指標(biāo)

2.2.1 勃起功能檢測 1)APO實(shí)驗(yàn):末次給藥后24 h,參照文獻(xiàn)[6]中對(duì)大鼠的勃起功能進(jìn)行檢測。將大鼠置于安靜的籠中適應(yīng)新環(huán)境10 min,取100 μg/kgAPO溶液于大鼠頸部皮下松弛皮膚注射,記錄大鼠30 min內(nèi)陰莖勃起次數(shù)。2)陰莖海綿體壓力(ICP)測定:APO實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,麻醉大鼠并處死,電針插入陰莖海綿體后計(jì)算其ICP值,電刺激穿刺針,每次刺激時(shí)間為60 s,20 min后進(jìn)行下一次電刺激,觀察ICP變化并記錄。

2.2.2 生育功能檢測 1)睪丸質(zhì)量和睪丸指數(shù):摘取大鼠左側(cè)睪丸和附睪,吸取表面血跡,稱取其質(zhì)量,計(jì)算臟器指數(shù)。2)附睪精子數(shù)量及存活率:取大鼠右側(cè)附睪浸泡于生理鹽水中,用生理鹽水稀釋,計(jì)數(shù)精子數(shù)量;根據(jù)精子的活動(dòng)情況,用顯微鏡計(jì)算活動(dòng)百分比。

2.2.3 TUNEL檢測陰莖海綿體組織細(xì)胞凋亡 取大鼠陰莖海綿體,一半置于多聚甲醛中固定,石蠟包埋,切片,烘干,沖洗干凈后加入終濃度為20 mg/L Proteinase K溶液,室溫孵育切片20 min;再次洗滌,加入1×Equilibration Buffer,孵育20 min后棄掉溶液,加入TdT溶液,孵育1 h(避光)。洗滌組織用DAPI染色,時(shí)長為5 min。顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡數(shù)量。凋亡率=(凋亡細(xì)胞數(shù)量/總細(xì)胞數(shù)量)×100%。

2.2.4 Western Blot檢測陰莖海綿體組織Bax、Bcl-2和caspase-1蛋白表達(dá) 取-80℃冰箱保存的另一半陰莖海綿體,研磨勻漿,離心,收集并檢測上清液中蛋白總濃度。配置濃縮和分離膠,將蛋白上樣加入到膠孔中,電泳10 min后轉(zhuǎn)膜。孵育PVDF膜2 h,在蛋白樣本中加入封閉液,封閉PVDF膜1 h。加入一抗Bax、Bcl-2和caspase-1孵育過夜,繼續(xù)加入HRP標(biāo)記的二抗,繼續(xù)孵育2 h。將ECL發(fā)光劑加入到細(xì)胞中曝光,用顯影液顯影,用Image Lab軟件檢測目的蛋白表達(dá)量。

3 結(jié)果

3.1 CVPEE對(duì)大鼠勃起功能的影響 見表1。

表1 各組大鼠勃起次數(shù)和ICP值比較

3.2 CVPEE對(duì)大鼠睪丸指數(shù)和附睪指數(shù)的影響 見表2。

表2 各組大鼠睪丸和附睪重量和指數(shù)比較

3.3 CVPEE對(duì)大鼠精子密度和精子存活率的影響 見表3。

表3 各組大鼠精子密度和精子存活率比較

3.4 CVPEE對(duì)陰莖海綿體細(xì)胞凋亡率的影響 各組大鼠陰莖海綿體細(xì)胞凋亡率相比:模型組[(35.12±2.34)%]明顯高于假手術(shù)組[(3.48±0.78)%](P<0.05),提取物低劑量組[(27.63±2.01)%]和提取物高劑量組[(12.54±1.25)%]、陽性組[(12.63±1.27)%]均低于模型組,提取物高劑量組低于提取物低劑量組(P<0.05),陽性組較提取物高劑量組無明顯差異(P>0.05)。

3.5 CVPEE對(duì)各組大鼠陰莖海綿體組織Bax、Bcl-2和caspase-1蛋白表達(dá)影響 與假手術(shù)組相比,模型組Bcl-2蛋白表達(dá)降低,Bax和caspase-1蛋白表達(dá)升高(P<0.05);和模型組相比,低劑量組和高劑量組Bcl-2表達(dá)升高,Bax和caspase-1蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。見圖1。

注:與假手術(shù)組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與低劑量組比較,△P<0.05

4 討論

研究發(fā)現(xiàn)ED發(fā)病率在10%～52%,尤以40～70歲男性居多。西方國家每年每1 000例男性人口中有25～30例新增勃起功能障礙病例。近年來調(diào)查顯示,我國超過90%的60歲男性患者有勃起功能障礙性疾病[7]。近些年隨著中醫(yī)的發(fā)展,馬鬃蛇治療勃起功能障礙疾病受到學(xué)者們的廣泛關(guān)注。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,馬鬃蛇醇提取物在對(duì)去勢小鼠的治療上,有一定的雄激素樣作用[8];毒性研究結(jié)果顯示,馬鬃蛇醇提取物在臨床的使用劑量上具有一定安全性[9]。以上研究結(jié)果為馬鬃蛇的開發(fā)提供了科學(xué)依據(jù),因此本研究建立動(dòng)脈性ED大鼠模型,觀察馬鬃蛇石油醚提取物對(duì)大鼠的勃起功能和生育功能的影響。

目前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中,檢測陰莖勃起功能的方法常用APO實(shí)驗(yàn)和ICP實(shí)驗(yàn)[10]。本研究結(jié)果顯示,模型組大鼠陰莖勃起次數(shù)和ICP值均降低,經(jīng)過不同劑量CVPEE干預(yù)后大鼠陰莖勃起次數(shù)和ICP值明顯增加,提示CVPEE可改善勃起功能。睪丸精曲小管上皮可產(chǎn)生大量精子,且其質(zhì)量好壞嚴(yán)重影響著睪丸質(zhì)量[11]。附睪可對(duì)精子進(jìn)行暫時(shí)性的儲(chǔ)存,可分泌大量的附睪液,進(jìn)而對(duì)精子成熟有促進(jìn)作用。因此,臨床常用睪丸、附睪的重量反應(yīng)生精功能,檢測精液質(zhì)量能直接反應(yīng)大鼠的生育能力[12]。本研究結(jié)果顯示,馬鬃蛇石油醚提取物能改善大鼠的生育能力。劉雪梅等[13]研究證實(shí),馬鬃蛇可通過增加睪丸質(zhì)量改善動(dòng)脈性比起功能大鼠性功能障礙。

陰莖海綿體是勃起的重要組織結(jié)構(gòu),陰莖海綿體細(xì)胞凋亡和勃起功能障礙密切相關(guān)[14]。研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞凋亡可維持生物體的正常發(fā)育,調(diào)控機(jī)體的內(nèi)在平衡,且能有效去除機(jī)體內(nèi)的癌細(xì)胞和受損細(xì)胞等[15]。生物的凋亡過程涉及多種相關(guān)基因共同作用。Bcl-2和Bax是最早被認(rèn)識(shí)的凋亡調(diào)控基因,二者所編碼的Bcl-2和Bax蛋白分別有抑制和促進(jìn)凋亡作用,二者的平衡介導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。Bcl-2家族是調(diào)控凋亡的核心因子,在不同的刺激下可調(diào)控抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax等。Wang等[16]研究證實(shí),糖尿病性勃起功能障礙大鼠陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞大量凋亡,通過抑制細(xì)胞中Bax和Caspase-1表達(dá)減少細(xì)胞凋亡。Caspase家族中位于凋亡通路下游的效應(yīng)酶Caspas-1蛋白起著關(guān)鍵作用,被認(rèn)為是凋亡最可靠的指標(biāo)。薛艷艷等[17]人研究證實(shí),ED大鼠中caspase-1表達(dá)增加,其介導(dǎo)ED的發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果顯示,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,馬鬃蛇石油醚提取物能減少陰莖海綿體細(xì)胞凋亡,調(diào)控Bax和Bcl-2蛋白平衡,抑制Caspase-1蛋白。

綜上所述,馬鬃蛇石油醚提取物可改善動(dòng)脈性勃起功能障礙大鼠勃起功能和生育功能,可能和抑制陰莖海綿體細(xì)胞凋亡和Caspase-1蛋白表達(dá)有關(guān)。