秦劭晨,王愛(ài)梅,萬(wàn)曉波

(1山西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院·山西 太原 030024;2太原市中醫(yī)醫(yī)院·山西 太原 030009)

偏頭痛作為一種普遍而復(fù)雜的神經(jīng)性疾病,主要癥狀為單側(cè)或雙側(cè)頭部的搏動(dòng)樣疼痛,反復(fù)發(fā)作,遷延不愈,常伴有惡心、嘔吐和畏光等癥狀[1]。偏頭痛在發(fā)生發(fā)展過(guò)程中會(huì)誘發(fā)嚴(yán)重的中樞炎癥反應(yīng)[2]。補(bǔ)陽(yáng)還五湯具有益氣補(bǔ)血、活血通絡(luò)的效果,對(duì)于氣虛血瘀偏頭痛患者具有良好的臨床療效[3],但其具體作用機(jī)制尚不明確。作為補(bǔ)陽(yáng)還五湯中佐藥之一的赤芍有效成分之一丹皮酚(Paeonol,Pae),具有鎮(zhèn)痛、抗炎、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)等作用[4],但在偏頭痛中的作用機(jī)制尚不明確。本研究采用腫瘤壞死因子α(TNF-α)刺激人星形膠質(zhì)細(xì)胞,構(gòu)建體外炎癥性神經(jīng)損傷模型,研究Pae對(duì)體外炎癥性神經(jīng)損傷模型的保護(hù)作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 人星形膠質(zhì)細(xì)胞株(HA1800)購(gòu)自中科院細(xì)胞庫(kù)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑 Pae:上海吉至生化科技公司,貨號(hào):C64600-50mg;地塞米松(DEX):上海麥克林生化科技公司,D917754。TNF-α:北京科興生物科技公司;NO、 MDA、LDH和SOD試劑盒:南京建成生物工程研究公司;TRIZOL:碧云天生物公司;引物:英濰捷基生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成。Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒:中國(guó)上海貝博生物科技公司;IL-1β、IL-18ELISA試劑盒:美國(guó)SAB公司;NLRP3和caspase-1ELISA試劑盒:美國(guó)Abcam公司;PrimeScriptTMRT reagent kit, TB Green?Premix Ex TaqTMII:Takara生物公司。DMEM培養(yǎng)基:中國(guó)Macklin公司;胎牛血清(FBS):澳大利亞Moregate公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱:美國(guó)Eppendorf公司;倒置顯微鏡:日本尼康公司;BT25S電子分析天平:德國(guó)Sartorius科技有限公司;PIKOREAL 96熒光定量PCR儀:美國(guó)Thermo Scientific公司;SORVALL Biofuge fresco冷凍離心機(jī):德國(guó)Kendro Labrotary公司;Varioskan LUX多功能酶標(biāo)儀:美國(guó)Thermo Fisher公司; Attune CytPix成像型流式細(xì)胞儀:美國(guó)Thermo Fisher公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HA1800細(xì)胞,分為正常組(NC)、模型組(TNF-α 10 μg/L)、Pae各濃度組和陽(yáng)性藥對(duì)照組(DEX,10μmol/L)。

2.2 觀察指標(biāo)

2.2.1 CCK8檢測(cè)Pae對(duì)HA1800細(xì)胞活力的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HA1800細(xì)胞接種于96孔板中(密度:5 000個(gè)/孔),12 h后去除培養(yǎng)上清加入終濃度為1.00、6.25、12.50、25.00、50.00、100.00、200.00 μmol/L的Pae刺激24 h后,加入CCK8孵育30 min,450 nm波長(zhǎng)酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔光密度(OD)值。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)不少于3次,取平均值。

2.2.2 分光光度法檢測(cè)細(xì)胞上清液NO、MDA、LDH和SOD水平 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HA1800細(xì)胞種于6孔板中(密度:2×105個(gè)/孔),在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h,正常組加入DMEM,除正常組外,各組均加入TNF-α(10 μg/L)刺激24 h,給藥組加入Pae(50 μmol/L)作用24 h,陽(yáng)性對(duì)照組加入Dex(10 μmol/L)作用24 h,收集細(xì)胞上清液,根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)不少于3次,取平均值。

2.2.3 ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清液IL-1β、IL-18、NLRP3、caspase-1水平 將HA1800細(xì)胞種于12孔板中(密度:5×104個(gè)/孔),在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h,細(xì)胞造模給藥方法參照2.2.2,收集細(xì)胞后加入Tirzol裂解液,提取RNA,-80℃凍存?zhèn)溆谩Ｊ占?xì)胞上清液,根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)不少于3次,取平均值。

2.2.4 RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞IL-1β、IL-18、NLRP3、caspase-1的mRNA 表達(dá) 取2.2.3備用的RNA,根據(jù)TAKARA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。Gene Bank數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索引物,由英濰捷基生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成。所有引物序列見(jiàn)表1。按照PCR擴(kuò)增試劑盒說(shuō)明書(shū)擴(kuò)增cDNA。PCR反應(yīng)體系的總體積為18μL。以95℃預(yù)變性5 min,95℃變性10 s,60℃退火30 s,95℃延伸15 s,共42個(gè)循環(huán)為反應(yīng)條件。計(jì)算結(jié)果用GAPDH標(biāo)化目的基因的相對(duì)表達(dá),通過(guò)2-ΔΔCt對(duì)目的基因進(jìn)行定量。

表1 PCR引物序列

2.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HA1800細(xì)胞種于6孔板中(密度:2×105個(gè)/孔),在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h,細(xì)胞造模給藥方法參照2.2.2。給藥結(jié)束后收集各孔細(xì)胞用預(yù)冷PBS離心洗滌,取400 μL 1× Annexin V結(jié)合液重懸細(xì)胞,細(xì)胞濃度2×105個(gè)/mL。5 μL Annexin V-FITC染色液加入細(xì)胞懸液,輕輕震蕩混勻,在2～8 ℃避光環(huán)境孵育15 min。加入PI染色液(10 μL)輕輕震蕩混勻,在2～8℃避光環(huán)境孵育5 min。最后,流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率。

3 結(jié)果

3.1 Pae對(duì)HA1800細(xì)胞活力的影響 各濃度的Pae作用于HA1800細(xì)胞,濃度在25.00～100.00 μmol/L對(duì)HA1800細(xì)胞均有明顯增殖作用,其中50.00 μmol/L、100.00 μmol/L的Pea對(duì)HA1800細(xì)胞增殖作用最明顯(P<0.01),結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各濃度Pae對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞活力的影響

3.2 Pae對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的HA1800細(xì)胞活力的影響 見(jiàn)表3。

表3 各濃度Pae對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的HA1800細(xì)胞活力的影響

3.3 Pae對(duì)TNF-α誘導(dǎo)HA1800細(xì)胞神經(jīng)損傷模型NO、MDA、LDH、SOD表達(dá)的影響 見(jiàn)表4。

表4 各組細(xì)胞上清液NO、MDA、LDH、SOD測(cè)定結(jié)果比較

3.4 Pae對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的HA1800細(xì)胞神經(jīng)損傷模型IL-1β、IL-18、NLRP3、Caspase-1表達(dá)水平的影響 見(jiàn)表5～表6。

表5 各組HA1800 細(xì)胞IL-1βmRNA、IL-18 mRNA、NLRP3 mRNA和Caspase-1 mRNA表達(dá)的比較

表6 各組HA1800 細(xì)胞培養(yǎng)上清液IL-1β、IL-18、NLRP3和Caspase-1含量比較

3.5 Pae對(duì)TNF-α誘導(dǎo)HA1800細(xì)胞神經(jīng)損傷模型細(xì)胞凋亡的影響 見(jiàn)表7。

表7 各組HA1800 細(xì)胞凋亡率比較

4 討論

偏頭痛作為一種神經(jīng)性炎癥疾病,其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,癥狀反復(fù)遷延難愈,補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)于氣虛血瘀型偏頭痛患者具有良好的臨床療效[5],其佐藥赤芍具有活血通絡(luò)的作用,Pae作為赤芍的有效成分,有良好的抗炎、抗氧化等藥理作用[6],本研究采用TNF-α刺激HA1800細(xì)胞的構(gòu)建體外炎癥性神經(jīng)損傷模型,探討Pae對(duì)于HA1800細(xì)胞的炎癥性神經(jīng)損傷狀態(tài)下的保護(hù)作用。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)的膠質(zhì)細(xì)胞有星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞,與神經(jīng)元密切連接的星形膠質(zhì)細(xì)胞,可支持和營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)元;同時(shí),因其與腦血管廣泛接觸,還可調(diào)節(jié)大腦血流量[7],由此,星形膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)系統(tǒng)中起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn),在神經(jīng)炎癥環(huán)境下可激活大腦中的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,釋放出炎性細(xì)胞因子激活神經(jīng)元,這些炎癥因子成為參與神經(jīng)性疼痛的介質(zhì),引起痛覺(jué)反應(yīng)[8]。因此,炎癥環(huán)境下的星形膠質(zhì)細(xì)胞與偏頭痛關(guān)系密切。

有研究提出三叉神經(jīng)-內(nèi)耳神經(jīng)血管的功能失調(diào)學(xué)說(shuō),指出刺激三叉神經(jīng)節(jié)和纖維使內(nèi)耳血流增加的同時(shí)肥大細(xì)胞活化,最后釋放炎性介質(zhì)、神經(jīng)致敏物質(zhì)等,產(chǎn)生炎癥反應(yīng),從而刺激痛覺(jué)纖維產(chǎn)生疼痛并傳入中樞,引起偏頭痛[9]。近年來(lái)神經(jīng)性偏頭痛中的炎癥反應(yīng)受到越來(lái)越多的關(guān)注,IL-1β、IL-18、NLRP3等炎癥介質(zhì)的釋放可引發(fā)神經(jīng)損傷的同時(shí)加重疼痛[10]。

細(xì)胞焦亡是一種不同于凋亡和壞死性凋亡的程序化炎癥性細(xì)胞死亡過(guò)程,表現(xiàn)為細(xì)胞腫脹、膜起泡、DNA斷裂和最終細(xì)胞裂解,然而,焦亡細(xì)胞核通常保持完整,這與中觀察到的細(xì)胞核破壞現(xiàn)象不同[11]。NLRP3炎癥小體的激活導(dǎo)致caspase-1活化,caspase-1活化后一方面切割gasdermin(GSDMD),形成含有GSDMD 氮端活性域的肽段,誘導(dǎo)細(xì)胞膜穿孔,細(xì)胞破裂,釋放內(nèi)容物,引起炎癥反應(yīng);另一方面,活化的caspase-1可切割I(lǐng)L-1β前體、IL-18前體,形成成熟的IL-1β和IL-18,釋放到細(xì)胞外,招募炎癥細(xì)胞聚集,擴(kuò)大炎癥反應(yīng),最終發(fā)生細(xì)胞焦亡[12-13]。而炎癥反應(yīng)與偏頭痛又有密切聯(lián)系,因此,本研究采用TNF-α刺激HA1800細(xì)胞,構(gòu)建體外炎癥性神經(jīng)損傷模型,研究Pae對(duì)體外炎癥性神經(jīng)損傷模型的保護(hù)作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn),TNF-α刺激HA1800細(xì)胞,造成體外炎癥性神經(jīng)損傷后,出現(xiàn)IL-1β、IL-18、NLRP3和caspase-1表達(dá)水平上調(diào),細(xì)胞活力被抑制,凋亡率上升,經(jīng)Pae干預(yù)后IL-1β、IL-18、NLRP3和caspase-1表達(dá)水平明顯下調(diào),細(xì)胞活力有所改善,凋亡率下調(diào)。提示,Pae可能通過(guò)抑制HA1800細(xì)胞焦亡從而起到抑制神經(jīng)炎癥改善偏頭痛的作用。

體內(nèi)氧化應(yīng)激(oxidative stress,OS)會(huì)導(dǎo)致炎癥性疾病的加劇[14]。有研究表明,氧化應(yīng)激水平增高會(huì)加劇神經(jīng)炎癥,而神經(jīng)炎癥與偏頭痛密切相關(guān)[15]。此外,大量研究結(jié)果提示偏頭痛患者外周血中氧化應(yīng)激水平增高[16],然而目前關(guān)于氧化應(yīng)激與偏頭痛相關(guān)的具體機(jī)制尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn),TNF-α刺激HA1800細(xì)胞,造成體外炎癥性神經(jīng)損傷后,NO、MDA、LDH水平上調(diào),SOD水平下調(diào),Pae干預(yù)后,NO、MDA、LDH水平下調(diào),SOD水平上調(diào),提示Pae可改善TNF-α誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn),在TNF-α刺激的HA1800細(xì)胞體外炎癥性神經(jīng)損傷模型中,Pae對(duì)可下調(diào)IL-1β、IL-18、NLRP3和caspase-1等細(xì)胞焦亡相關(guān)的炎癥介質(zhì)的過(guò)度分泌,改善氧化應(yīng)激反應(yīng),提示Pae可能通過(guò)抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞焦亡狀態(tài)從而抑制神經(jīng)炎癥改善偏頭痛的作用。Pae是補(bǔ)陽(yáng)還五湯的主要有效成分,補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)于偏頭痛患者有良好的臨床療效,推測(cè)在偏頭痛患者中補(bǔ)陽(yáng)還五湯可通過(guò)其有效成分Pae抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞焦亡,減輕炎癥反應(yīng),從而達(dá)到改善神經(jīng)炎癥緩解偏頭痛的作用,但其具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。