姚 琪,李佳寅

(嘉興市第一醫(yī)院·浙江 嘉興 314000)

氧化應(yīng)激損傷在心血管疾病的發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用并且受到廣泛重視,研究證實(shí)氧化應(yīng)激在心肌缺氧、缺血及再灌注損傷等多個(gè)病理生理過程中均有重要作用,均會(huì)引起心肌細(xì)胞的凋亡或壞死[1]。心肌細(xì)胞屬于不可再生的高度分化細(xì)胞,因此如何抑制氧化應(yīng)激及降低心肌細(xì)胞凋亡是研究心血管疾病的熱點(diǎn)。橘皮素是在柑橘中第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)具有大量多甲氧基黃酮的物質(zhì),在抗癌、抗炎及治療心血管疾病中具有較好的作用[2]。近些年,其研究較為廣泛,生物利用度方面位居所有多甲氧基黃酮單體中前列[3]。本研究重點(diǎn)探討了橘皮素對(duì)雙氧水致心肌細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用及與PI3K/AKT信號(hào)通路的相關(guān)性,現(xiàn)報(bào)道下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 橘皮素:Macklin公司,貨號(hào):C13883344,純度95%;H9C2心肌細(xì)胞:上海中喬新舟生物科技。低糖DMEM培養(yǎng)基:Hyclone公司;胎牛血清:Gibco公司;CCK8試劑盒:Elabscience公司,貨號(hào):E-CK-A362;ROS試劑盒:南京建成公司,貨號(hào):E004-1-1;Western blot抗體:Affinity公司,PI3K(貨號(hào):AF6242)、Akt(貨號(hào):AF6261)、p-Akt(貨號(hào):AF0016)、β-actin(貨號(hào):AF7018)、羊抗兔二抗(貨號(hào):S0001)。ELX800酶標(biāo)儀:BIOTEK公司,);LSR Fortessa流式細(xì)胞儀:BD公司。

1.2 橘皮素溶液的配制 采用分析天平,稱取1.57 mg橘皮素,再加500 μL DMSO,充分溶解后,加9.5 mL完全培養(yǎng)基,用孔徑0.22 μm的過濾器過濾除去細(xì)菌,母液濃度為400 μmol/L,依據(jù)預(yù)先試驗(yàn)結(jié)果,最終添加到細(xì)胞內(nèi)的濃度為5 μmol/L。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) H9C2心肌細(xì)胞培養(yǎng)于37 ℃,含5% CO2培養(yǎng)箱中,于低糖DMEM培養(yǎng)基加入10%胎牛血清,待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%后進(jìn)行傳代。

1.4 細(xì)胞分組及處理 H9C2細(xì)胞鋪板后進(jìn)行分組,分別為:正常組(Control):常規(guī)培養(yǎng),與其他組別同步換液處理;氧化損傷組(ODG):待細(xì)胞培養(yǎng)密度為70%時(shí),添加H2O2,濃度為600 μmol/L,作用時(shí)間12 h;橘皮素組(Tangeretin):在制備氧化損傷模型前,添加橘皮素5 μmol/L,作用時(shí)間12 h。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力值 1)H9C2心肌細(xì)胞在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)消化,鋪96孔板,每孔鋪6 000細(xì)胞,培養(yǎng)24 h;2) 分別對(duì)3組細(xì)胞進(jìn)行換液或加藥處理, ODG組建立氧化損傷模型,橘皮素組采用橘皮素5 μ mol/L預(yù)先處理12 h;3)將10 uL CCK8溶液加入每孔中;4)使用酶標(biāo)儀設(shè)定檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm,并測(cè)量各組的吸光度值;5) 計(jì)算細(xì)胞活力值,細(xì)胞活力值=(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白孔OD值)/(Control組OD值-空白孔OD值)×100%。

1.5.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞ROS表達(dá) 細(xì)胞接種于6孔板,經(jīng)相應(yīng)處理后,將DCFH-DA (10 μ mol/L)加入6孔板,37 ℃培養(yǎng)30 min, PBS清洗3次,導(dǎo)入流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞內(nèi) ROS。

1.5.3 Western blot檢測(cè)各組PI3K/Akt通路蛋白的表達(dá) 3組細(xì)胞經(jīng) PBS浸潤(rùn)清洗后置于冰上,加入 RIPA裂解液提取蛋白,通過BCA法測(cè)定蛋白濃度,調(diào)整濃度,加入3×loading buffer,95 ℃變性5 min,制分離膠和濃縮膠,蛋白電泳,轉(zhuǎn)膜,加入BSA室溫?fù)u床封閉2 h, PBS洗膜后4 ℃搖床上孵育一抗PI3K(1∶1 000)、P-Akt(1∶1 000)、 Akt(1∶1 000)、β-actin(1∶1 000)、β-actin(1∶1 000)、孵育時(shí)長(zhǎng)12 h,洗膜后室溫下孵育辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗2 h,PBS充分清洗后顯影。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞活性比較 見表1。

表1 各組細(xì)胞活力值比較

2.2 各組細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)量的比較分析 見圖1。

注:與Control組比較,*P<0.05;與ODG組比較,#P<0.05

2.3 各組細(xì)胞PI3K/Akt通路蛋白表達(dá)的Western blot檢測(cè)結(jié)果 見圖2。

注:與 Control組比較,*P<0.05;與ODG組比較,#P<0.05

3 討論

橘皮素屬于天然多甲氧基黃酮的一種,主要提取于柑橘果皮[4]。柑橘果皮也稱為陳皮,屬于傳統(tǒng)中藥,主要功效為燥濕化痰、理氣健脾?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)證實(shí):陳皮在防治動(dòng)脈粥樣硬化中具有較好的療效[5-6]。橘皮素為弱極性,具有疏水性,分子量較低,分子式為C20H20O7,其特性易于通過細(xì)胞膜的磷脂雙分子層,從而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮其藥理作用[7]。此外,橘皮素相較于目前已報(bào)道的黃烷酮類單體具有更好的口服吸收利用率與生物利用率,目前已證實(shí)在保護(hù)神經(jīng)元、降血壓、抗癌、抗炎等方面均有作用[7-8],因此其生物活性與結(jié)構(gòu)特征均受到科研工作者的普遍關(guān)注。本研究重點(diǎn)探討了橘皮素對(duì)于心肌細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用及與ROS表達(dá)及PI3K/Akt信號(hào)通路的相關(guān)作用。

雙氧水是ROS表達(dá)的誘導(dǎo)劑,經(jīng)常用于各類細(xì)胞的氧化應(yīng)激研究[9],當(dāng)線粒體產(chǎn)生過多的ROS后,機(jī)體就會(huì)產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng),導(dǎo)致 DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)過氧化、抗氧化酶活性降低,從而損傷細(xì)胞[10]。PI3K/Akt信號(hào)可由ROS的表達(dá)而激活,ROS在其中發(fā)揮了第二信使的作用[11]。內(nèi)源性抗氧化劑的消耗與氧化應(yīng)激的增加均會(huì)引起心肌細(xì)胞的損傷與凋亡,PI3K屬于細(xì)胞質(zhì)脂類激酶,PI3K通路中的Akt為關(guān)鍵激酶。PI3K屬于異二聚體,由催化亞基p110和調(diào)節(jié)亞基p85組成,PI3K磷酸化的同時(shí)會(huì)生成磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸(PIP3),招募并引起Akt磷酸化,調(diào)控了氧化應(yīng)激、凋亡、生長(zhǎng)等多種生理活動(dòng),在心血管疾病中起到了關(guān)鍵作用[12-13]。

研究證實(shí):激活PI3K/Akt信號(hào)通路能有效抑制心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激,減少心肌細(xì)胞凋亡,同時(shí)心梗面積也得到有效控制[14-15]。此外,激活PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)H9C2心肌細(xì)胞凋亡有明顯的抑制作用,同時(shí)PI3K抑制劑LY294002可以阻斷H9C2心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷[16-17]。基于上述理論,本研究首先構(gòu)建H9C2氧化損傷心肌細(xì)胞,經(jīng)5μmol/L橘皮素預(yù)處理,證實(shí)橘皮素對(duì)H9C2心肌細(xì)胞氧化損傷有明顯的保護(hù)作用,流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示橘皮素對(duì)ROS表達(dá)有明顯的抑制作用。同時(shí), Western blot也證實(shí),橘皮素預(yù)處理能有效促進(jìn)PI3K/Akt通路激活。

綜合上述:橘皮素預(yù)處理可有效發(fā)揮對(duì)雙氧水致心肌細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用,其機(jī)制可能與PI3K/AKT信號(hào)通路的激活相關(guān)。