姚 琪,李佳寅

(嘉興市第一醫(yī)院·浙江 嘉興 314000)

氧化應激損傷在心血管疾病的發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用并且受到廣泛重視,研究證實氧化應激在心肌缺氧、缺血及再灌注損傷等多個病理生理過程中均有重要作用,均會引起心肌細胞的凋亡或壞死[1]。心肌細胞屬于不可再生的高度分化細胞,因此如何抑制氧化應激及降低心肌細胞凋亡是研究心血管疾病的熱點。橘皮素是在柑橘中第一個被發(fā)現(xiàn)具有大量多甲氧基黃酮的物質,在抗癌、抗炎及治療心血管疾病中具有較好的作用[2]。近些年,其研究較為廣泛,生物利用度方面位居所有多甲氧基黃酮單體中前列[3]。本研究重點探討了橘皮素對雙氧水致心肌細胞氧化損傷的保護作用及與PI3K/AKT信號通路的相關性,現(xiàn)報道下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 橘皮素:Macklin公司,貨號:C13883344,純度95%;H9C2心肌細胞:上海中喬新舟生物科技。低糖DMEM培養(yǎng)基:Hyclone公司;胎牛血清:Gibco公司;CCK8試劑盒:Elabscience公司,貨號:E-CK-A362;ROS試劑盒:南京建成公司,貨號:E004-1-1;Western blot抗體:Affinity公司,PI3K(貨號:AF6242)、Akt(貨號:AF6261)、p-Akt(貨號:AF0016)、β-actin(貨號:AF7018)、羊抗兔二抗(貨號:S0001)。ELX800酶標儀:BIOTEK公司,);LSR Fortessa流式細胞儀:BD公司。

1.2 橘皮素溶液的配制 采用分析天平,稱取1.57 mg橘皮素,再加500 μL DMSO,充分溶解后,加9.5 mL完全培養(yǎng)基,用孔徑0.22 μm的過濾器過濾除去細菌,母液濃度為400 μmol/L,依據(jù)預先試驗結果,最終添加到細胞內的濃度為5 μmol/L。

1.3 細胞培養(yǎng) H9C2心肌細胞培養(yǎng)于37 ℃,含5% CO2培養(yǎng)箱中,于低糖DMEM培養(yǎng)基加入10%胎牛血清,待細胞生長至80%后進行傳代。

1.4 細胞分組及處理 H9C2細胞鋪板后進行分組,分別為:正常組(Control):常規(guī)培養(yǎng),與其他組別同步換液處理;氧化損傷組(ODG):待細胞培養(yǎng)密度為70%時,添加H2O2,濃度為600 μmol/L,作用時間12 h;橘皮素組(Tangeretin):在制備氧化損傷模型前,添加橘皮素5 μmol/L,作用時間12 h。

1.5 觀察指標

1.5.1 CCK8實驗檢測細胞活力值 1)H9C2心肌細胞在對數(shù)生長期內消化,鋪96孔板,每孔鋪6 000細胞,培養(yǎng)24 h;2) 分別對3組細胞進行換液或加藥處理, ODG組建立氧化損傷模型,橘皮素組采用橘皮素5 μ mol/L預先處理12 h;3)將10 uL CCK8溶液加入每孔中;4)使用酶標儀設定檢測波長450 nm,并測量各組的吸光度值;5) 計算細胞活力值,細胞活力值=(實驗組OD值-空白孔OD值)/(Control組OD值-空白孔OD值)×100%。

1.5.2 流式細胞術檢測細胞ROS表達 細胞接種于6孔板,經(jīng)相應處理后,將DCFH-DA (10 μ mol/L)加入6孔板,37 ℃培養(yǎng)30 min, PBS清洗3次,導入流式細胞儀測定細胞內 ROS。

1.5.3 Western blot檢測各組PI3K/Akt通路蛋白的表達 3組細胞經(jīng) PBS浸潤清洗后置于冰上,加入 RIPA裂解液提取蛋白,通過BCA法測定蛋白濃度,調整濃度,加入3×loading buffer,95 ℃變性5 min,制分離膠和濃縮膠,蛋白電泳,轉膜,加入BSA室溫搖床封閉2 h, PBS洗膜后4 ℃搖床上孵育一抗PI3K(1∶1 000)、P-Akt(1∶1 000)、 Akt(1∶1 000)、β-actin(1∶1 000)、β-actin(1∶1 000)、孵育時長12 h,洗膜后室溫下孵育辣根過氧化物酶標記的二抗2 h,PBS充分清洗后顯影。

2 結果

2.1 各組細胞活性比較 見表1。

表1 各組細胞活力值比較

2.2 各組細胞內ROS表達量的比較分析 見圖1。

注:與Control組比較,*P<0.05;與ODG組比較,#P<0.05

2.3 各組細胞PI3K/Akt通路蛋白表達的Western blot檢測結果 見圖2。

注:與 Control組比較,*P<0.05;與ODG組比較,#P<0.05

3 討論

橘皮素屬于天然多甲氧基黃酮的一種,主要提取于柑橘果皮[4]。柑橘果皮也稱為陳皮,屬于傳統(tǒng)中藥,主要功效為燥濕化痰、理氣健脾。現(xiàn)代醫(yī)學證實:陳皮在防治動脈粥樣硬化中具有較好的療效[5-6]。橘皮素為弱極性,具有疏水性,分子量較低,分子式為C20H20O7,其特性易于通過細胞膜的磷脂雙分子層,從而進入細胞內發(fā)揮其藥理作用[7]。此外,橘皮素相較于目前已報道的黃烷酮類單體具有更好的口服吸收利用率與生物利用率,目前已證實在保護神經(jīng)元、降血壓、抗癌、抗炎等方面均有作用[7-8],因此其生物活性與結構特征均受到科研工作者的普遍關注。本研究重點探討了橘皮素對于心肌細胞氧化損傷的保護作用及與ROS表達及PI3K/Akt信號通路的相關作用。

雙氧水是ROS表達的誘導劑,經(jīng)常用于各類細胞的氧化應激研究[9],當線粒體產生過多的ROS后,機體就會產生應激反應,導致 DNA、蛋白質、脂質過氧化、抗氧化酶活性降低,從而損傷細胞[10]。PI3K/Akt信號可由ROS的表達而激活,ROS在其中發(fā)揮了第二信使的作用[11]。內源性抗氧化劑的消耗與氧化應激的增加均會引起心肌細胞的損傷與凋亡,PI3K屬于細胞質脂類激酶,PI3K通路中的Akt為關鍵激酶。PI3K屬于異二聚體,由催化亞基p110和調節(jié)亞基p85組成,PI3K磷酸化的同時會生成磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸(PIP3),招募并引起Akt磷酸化,調控了氧化應激、凋亡、生長等多種生理活動,在心血管疾病中起到了關鍵作用[12-13]。

研究證實:激活PI3K/Akt信號通路能有效抑制心肌細胞氧化應激,減少心肌細胞凋亡,同時心梗面積也得到有效控制[14-15]。此外,激活PI3K/Akt信號通路對H9C2心肌細胞凋亡有明顯的抑制作用,同時PI3K抑制劑LY294002可以阻斷H9C2心肌細胞的氧化應激損傷[16-17]?；谏鲜隼碚?本研究首先構建H9C2氧化損傷心肌細胞,經(jīng)5μmol/L橘皮素預處理,證實橘皮素對H9C2心肌細胞氧化損傷有明顯的保護作用,流式細胞儀檢測顯示橘皮素對ROS表達有明顯的抑制作用。同時, Western blot也證實,橘皮素預處理能有效促進PI3K/Akt通路激活。

綜合上述:橘皮素預處理可有效發(fā)揮對雙氧水致心肌細胞氧化損傷的保護作用,其機制可能與PI3K/AKT信號通路的激活相關。