曹 莉,袁 雪,張飛娥,錢金梅,張小玲,蔡 巖

0 引言

翼狀胬肉是一種常見的眼表疾病,世界范圍內發(fā)病率為1.3%～53%[1]。手術是治療翼狀胬肉的主要方式,但翼狀胬肉術后復發(fā)率高。有研究表明翼狀胬肉的發(fā)生發(fā)展與翼狀胬肉細胞的增殖、凋亡和遷移有關[2]。臨床上通過術中使用絲裂霉素等抗代謝藥物降低翼狀胬肉的術后復發(fā)率,但這些藥物可能會引起鞏膜溶解等一系列嚴重并發(fā)癥[3]。因此,需要尋找更加安全有效的藥物來治療翼狀胬肉和降低翼狀胬肉術后復發(fā)率。姜黃素(curcumin,Cur)是從姜黃等植物的根莖中提取得到的疏水性多酚化合物,具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗纖維化等作用,而無明顯毒副作用[4-7]。故本研究用姜黃素對人翼狀胬肉成纖維(human pterygium fibroblasts,HPF)細胞進行干預,觀察姜黃素對HPF細胞增殖、凋亡和遷移的影響,以及對Bcl-2相關X蛋白(B-cell lymphoma-2 associated X protein,Bax)、B細胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、細胞周期蛋白D1(Cyclin D1,CCND1)、基質金屬蛋白酶2 (matrix metalloproteinase 2,MMP2)的mRNA與蛋白表達的影響,以期為翼狀胬肉的治療提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 取材收集新疆軍區(qū)總醫(yī)院全軍眼科中心在2021-11-24/12-16手術切除的翼狀胬肉組織7例。納入標準:(1)按照診斷標準確診的位于鼻側的原發(fā)性翼狀胬肉;(2)頭部平坦,體部菲薄,無明顯充血的靜止期翼狀胬肉;(3)頭部侵入角膜2～4mm。排除標準:(1)復發(fā)性翼狀胬肉;(2)活動性眼部炎癥;(3)假性翼狀胬肉;(4)單眼多發(fā)的翼狀胬肉[8]。本研究遵守《赫爾辛基宣言》,通過新疆軍區(qū)總醫(yī)院倫理委員會審批(No.20210301007)。所有患者知情并簽署知情同意書。

1.1.2 主要試劑與儀器姜黃素(美國Sigma公司)、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(美國Gibco公司)、DMEM/F12(1∶1)液體培養(yǎng)基(美國HyClone公司)、二甲基亞砜(美國Sigma公司)、CCK8試劑盒(北京博奧森生物技術有限公司)、Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒(北京博奧森生物技術有限公司)、動物組織總RNA提取試劑盒(成都福際生物技術有限公司)、兔抗人Vimentin抗體(ab92547, 美國Abcam公司)、兔抗人Pan Cytokeratin抗體(ab234297,美國Abcam公司)、兔抗人Bax抗體(ab182733,美國Abcam公司)、兔抗人Bcl-2抗體(ab182858,美國Abcam公司)、兔抗人Cyclin D1抗體(ab134175,美國Abcam公司)、兔抗人MMP2抗體(ab92536,美國Abcam公司)、兔抗人β-Actin抗體(bs-0061R,北京博奧森生物技術有限公司)、Alexa Fluor 488標記驢抗兔IgG二抗(ab150073,美國Abcam公司)、HRP標記羊抗兔IgG二抗(bs-40295G-HRP,北京博奧森生物技術有限公司)、Transwell小室(美國Corning公司)、酶標儀(美國Thermo公司)、流式細胞儀(美國BD公司)、實時熒光定量PCR儀(美國Thermo公司)、電泳儀及電轉儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1HPF細胞的體外培養(yǎng)將手術切除的翼狀胬肉頭、體、頸部組織保存于含100U/mL青霉素、100mg/L鏈霉素的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution,PBS)中,在超凈工作臺上用PBS沖洗翼狀胬肉組織3次,將翼狀胬肉剪成約1mm×1mm×1mm大小的組織塊,將剪碎的組織塊平鋪于細胞培養(yǎng)皿,等待30min,待組織塊貼壁后向培養(yǎng)皿中加入含100U/mL青霉素、100mg/L鏈霉素及10%FBS的DMEM/F12完全培養(yǎng)基,將培養(yǎng)皿放置于37℃,5%CO2細胞培養(yǎng)箱中,每2～3d換液一次,待細胞密度生長到80%～90%時采用0.25%胰蛋白酶消化傳代,取3～6代細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2 細胞鑒定將HPF細胞接種于激光共聚焦培養(yǎng)皿中,待細胞密度生長到80%后吸除培養(yǎng)基,PBS浸洗,4%多聚甲醛室溫固定細胞15min。PBS浸洗,0.5%曲拉通X-100室溫通透細胞30min。PBS浸洗,5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)室溫封閉1h。棄封閉液,分別加入5%BSA、用5%BSA稀釋的兔抗人Vimentin抗體(1∶250)、用5%BSA稀釋的兔抗人Pan Cytokeratin抗體(1∶250),4℃孵育過夜。PBS浸洗,加入用5%BSA稀釋的Alexa Fluor 488標記驢抗兔IgG二抗(1∶200),室溫避光孵育1h。PBS浸洗,加入DAPI避光孵育10min。PBS浸洗,使用熒光顯微鏡觀察發(fā)射波長為488nm時蛋白的表達情況。

1.2.3CCK8法檢測HPF細胞增殖情況及細胞分組使用二甲基亞砜將姜黃素粉劑配制成100mmol/L的濃儲液儲存于-20℃,使用時用完全培養(yǎng)基稀釋成相應濃度,并且各個濃度的姜黃素中均含有等量的二甲基亞砜。將HPF細胞以5×103個/孔的密度接種于96孔板,設置3個復孔。HPF細胞貼壁過夜后吸除培養(yǎng)基,向培養(yǎng)孔中加入分別含0、10、20、40、80、160μmol/L姜黃素的完全培養(yǎng)基100μL。姜黃素處理HPF細胞24h后吸除培養(yǎng)基并用PBS清洗細胞1次,向培養(yǎng)孔中加入10μL CCK8反應液與90μL DMEM/F12培養(yǎng)基,于37℃,5%CO2孵箱中孵育1.5h后使用酶標儀測量各孔在450nm處的吸光度。計算細胞活力,并使用GraphPad 7.0軟件篩選出細胞活力為50%的姜黃素濃度,即半數抑制濃度。以細胞活力為50%左右的姜黃素濃度為高濃度處理組(40μmol/L姜黃素組),濃度遞減50%為低濃度處理組(20μmol/L姜黃素組),同時設對照組(不含姜黃素),每組用相應濃度姜黃素處理HPF細胞24h。

1.2.4 流式細胞儀檢測HPF細胞凋亡情況各組HPF細胞經相應濃度姜黃素處理24h后收集細胞,用500μL 1×Binding Buffer重懸細胞,加入5μL Annexin V-FITC和5μL PI,避光孵育15min后用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.2.5Transwell遷移實驗檢測HPF細胞遷移情況將HPF細胞以1×105個/孔的密度接種于Transwell小室的上室,并在上室中加入相應濃度的姜黃素(用無血清培養(yǎng)基配制)200μL,在下室中加入含20%FBS的完全培養(yǎng)基600μL。將Transwell小室放置于37℃,5%CO2細胞培養(yǎng)箱中,24h后取出Transwell小室的上室。PBS洗滌3次,4%多聚甲醛固定細胞20min,PBS洗滌3次,0.1%結晶紫染色20min,PBS洗滌3次,用棉簽擦去上室中未遷移的細胞,PBS洗滌3次,晾干后在顯微鏡下觀察遷移細胞并隨機選取5個視野計數。

1.2.6 實時熒光定量PCR檢測各組HPF細胞Bax、Bcl-2、CyclinD1及MMP2mRNA表達各組HPF細胞經相應濃度姜黃素處理24h后按照動物組織總RNA提取試劑盒說明書提取細胞總RNA,按照Takara反轉錄試劑盒說明書將RNA反轉錄為cDNA,按照Takara熒光定量試劑盒說明書進行實時熒光定量PCR反應。使用2-△△Ct法計算目標基因的相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.7Westernblot法檢測各組HPF細胞Bax、Bcl-2、CyclinD1及MMP2的蛋白表達各組HPF細胞經相應濃度姜黃素處理24h后用PBS浸洗3次。棄PBS后用RIPA裂解液冰上裂解細胞30min,4℃ 12000r/min離心15min后收集上清液。以BCA法對蛋白定量,上清液中加入適量體積的PBS和蛋白上樣緩沖液使得最終蛋白濃度為2μg/μL,100℃蛋白變性10min后于-80℃保存。行12% SDS-PAGE電泳,上樣量為20μL,80V電泳30min后改為100V繼續(xù)電泳1h。采用濕轉的方式(100mA,1h)將蛋白電轉到PVDF膜上。TBST洗膜3次,5%脫脂牛奶封閉2h。TBST洗膜3次,分別加入用抗體稀釋液稀釋的兔抗人Bax抗體(1∶1000)、兔抗人Bcl-2抗體(1∶1000)、兔抗人Cyclin D1抗體(1∶1000)、兔抗人MMP2抗體(1∶1000)、兔抗人β-Actin抗體(1∶5000),4℃孵育過夜。TBST洗膜3次,加入用抗體稀釋液稀釋的HRP標記羊抗兔IgG二抗(1∶5000)室溫孵育2h。TBST洗膜3次,滴加ECL后進行顯色。使用Image J計算各個條帶的灰度值。

統計學分析:采用SPSS24.0對數據進行統計學分析,計量資料符合正態(tài)分布者采用均數±標準差表示。組間比較采用單因素方差分析;方差齊時,組間兩兩比較使用LSD-t法;方差不齊時,組間兩兩比較使用Tamhanr’s T2法。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1HPF細胞的培養(yǎng)與鑒定組織塊培養(yǎng)第3～5d開始出現少量長梭形細胞從組織塊邊緣爬出(圖1A)。傳代至第3代后,細胞為形態(tài)均一的長梭形(圖1B)。免疫熒光染色顯示細胞波形蛋白表達陽性(圖1C),廣譜細胞角蛋白表達陰性(圖1D)。結合標本組織來源、細胞形態(tài)學觀察及免疫熒光染色結果,可證明本研究培養(yǎng)的細胞為HPF細胞。

圖1 HPF細胞的培養(yǎng)及鑒定 A:組織塊法培養(yǎng)的HPF細胞;B:第3代HPF細胞;C:HPF細胞波形蛋白表達陽性;D:HPF細胞廣譜細胞角蛋白表達陰性。

2.2 姜黃素對HPF細胞增殖的影響與對照組相比,濃度為10、20、40、80、160μmol/L的姜黃素均能抑制HPF細胞的增殖,差異有統計學意義(P<0.05),見圖2。并且HPF細胞活力隨姜黃素濃度的增加逐漸降低。40μmol/L姜黃素處理24h后HPF細胞活力為54.18%±3.71%,該濃度接近姜黃素的半數抑制濃度(46.38μmol/L),故將高濃度組設為40μmol/L姜黃素組,低濃度組設為20μmol/L姜黃素組,同時設對照組(不含姜黃素)。

圖2 姜黃素對HPF細胞增殖的影響(n=3) aP<0.05 vs 對照組;cP<0.05 vs 20μmol/L姜黃素組。

2.3 三組HPF細胞凋亡情況比較對照組凋亡率為9.18%±0.77%,20μmol/L姜黃素組凋亡率為11.37%±0.87%,40μmol/L姜黃素組凋亡率為31.73%±0.68%,三組間比較差異有統計學意義(F=771.77,P<0.05),20μmol/L和40μmol/L姜黃素組與對照組比較差異均有統計學意義(P<0.05),40μmol/L姜黃素組與20μmol/L姜黃素組比較差異有統計學意義(P<0.05),見圖3。

圖3 三組HPF細胞凋亡情況比較(n=3) A:對照組;B:20μmol/L姜黃素組;C:40μmol/L姜黃素組;D:柱狀圖;aP<0.05 vs 對照組;cP<0.05 vs 20μmol/L姜黃素組。

2.4 三組HPF細胞遷移情況比較對照組遷移細胞數為88.80±2.46個,20μmol/L姜黃素組遷移細胞數為70.00±2.91個,40μmol/L姜黃素組遷移細胞數為43.67±8.03個,三組間比較差異有統計學意義(F=58.58,P<0.05),20μmol/L和40μmol/L姜黃素組與對照組比較差異均有統計學意義(P<0.05),40μmol/L姜黃素組與20 μmol/L姜黃素組比較差異有統計學意義(P<0.05),見圖4。

圖4 三組HPF細胞遷移情況比較(n=3) A:對照組;B:20μmol/L姜黃素組;C:40μmol/L姜黃素組;D:柱狀圖;aP<0.05 vs 對照組;cP<0.05 vs 20μmol/L姜黃素組。

2.5 三組HPF細胞Bax、Bcl-2、CyclinD1、MMP2mRNA表達比較三組間促凋亡基因Bax、抗凋亡基因Bcl-2、增殖調控相關基因Cyclin D1、遷移相關基因MMP2的mRNA表達比較差異均有統計學意義(P<0.05)。20μmol/L姜黃素組Bcl-2的mRNA表達與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05),與對照組比較,20μmol/L姜黃素組能上調Bax、下調Cyclin D1、MMP2 mRNA表達,差異均有統計學意義(P<0.05)。與對照組相比,40μmol/L姜黃素組能上調Bax、下調Bcl-2、Cyclin D1、MMP2 mRNA表達,差異均有統計學意義(P<0.05)。40μmol/L與20μmol/L姜黃素組Bcl-2和Cyclin D1的mRNA表達比較差異均無統計學意義(P>0.05),與20μmol/L姜黃素組相比40μmol/L姜黃素組能下調MMP2和上調Bax mRNA表達,差異均有統計學意義(P<0.05),見表2,圖5。

圖5 三組HPF細胞Bax、Bcl-2、Cyclin D1、MMP2 mRNA表達比較(n=3) aP<0.05 vs 對照組;cP<0.05 vs 20μmol/L姜黃素組。

表2 三組HPF細胞Bax、Bcl-2、Cyclin D1、MMP2 mRNA表達比較

2.6 三組HPF細胞Bax、Bcl-2、CyclinD1、MMP2蛋白表達比較三組間Bax、Bcl-2、Cyclin D1、MMP2的蛋白表達水平差異均有統計學意義(P<0.05)。20μmol/L姜黃素組Bax、Cyclin D1及MMP2的蛋白表達與對照組比較差異均無統計學意義(P>0.05),20μmol/L姜黃素組與對照組比較能下調Bcl-2蛋白表達,差異有統計學意義(P<0.05)。40μmol/L姜黃素組與對照組比較能下調Bcl-2、Cyclin D1及MMP2的蛋白表達,上調Bax的蛋白表達,差異均有統計學意義(P<0.05)。40μmol/L與20μmol/L姜黃素組Cyclin D1及MMP2的蛋白表達比較差異均無統計學意義(P>0.05)。與20μmol/L姜黃素組相比,40μmol/L姜黃素組能下調Bcl-2的蛋白表達水平,上調Bax的蛋白表達水平,差異均有統計學意義(P<0.05),見表3,圖6。

表3 三組HPF細胞Bax、Bcl-2、Cyclin D1、MMP2蛋白表達比較

圖6 三組HPF細胞Bax、Bcl-2、Cyclin D1、MMP2 蛋白表達比較(n=3) A:Western blot結果;B:柱狀圖;aP<0.05 vs 對照組;cP<0.05 vs 20μmol/L姜黃素組。

3 討論

翼狀胬肉是一種以局部球結膜纖維血管組織增生并侵犯角膜為特點的常見眼表疾病,可引起視力下降、進行性散光、眼表不適等癥狀[9]。紫外線照射、抑癌基因失活、上皮—間質細胞轉化等是目前公認的翼狀胬肉發(fā)病的原因,但各因素的具體作用機制有待進一步研究[10]。盡管學者們提出了翼狀胬肉切除+自體結膜瓣移植術、翼狀胬肉切除+結膜瓣轉位術、翼狀胬肉切除+自體角膜緣干細胞移植術、翼狀胬肉切除+羊膜移植術等新型手術方式,翼狀胬肉術后復發(fā)率仍高[11]。傳統中藥姜黃最早記載于《新修本草》,有破血行氣,通經止痛的功效[12]。姜黃素作為中藥姜黃發(fā)揮藥理作用的主要活性成分,因其良好的抗腫瘤、抗纖維化等作用而無明顯毒副作用受到廣泛關注[6-7]?，F有的研究表明姜黃素能誘導前列腺癌成纖維細胞的G2/M期阻滯和細胞凋亡,能抑制心臟成纖維細胞的增殖、遷移和膠原生成,能降低TGF-β1誘導的眼眶成纖維細胞分化并減弱眼眶成纖維細胞的促血管生成活性[13-15]。本研究發(fā)現姜黃素能抑制HPF細胞的增殖和遷移,并誘導其凋亡,提示姜黃素可能通過抑制HPF細胞增殖與遷移,及誘導HPF細胞凋亡來阻礙翼狀胬肉的發(fā)展。

姜黃素能通過抑制細胞增殖來抑制肺癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展[16]。翼狀胬肉與具有惡性增殖能力的腫瘤有著某些相同的特性。與邊芳等[17]的研究結果相似,本研究也發(fā)現姜黃素能抑制HPF細胞的增殖。Cyclin D1可以通過正向調控細胞周期進程來促進癌細胞增殖,而Sare等[18]研究表明姜黃素能通過下調Cyclin D1的表達來抑制肝癌細胞的增殖。與此類似,本研究證實姜黃素能抑制HPF細胞的增殖,并能下調Cyclin D1的表達水平。

細胞凋亡是由基因控制的細胞程序化死亡,抗凋亡基因Bcl-2的下調和促凋亡基因Bax的上調可以誘導細胞的凋亡。姜黃素能上調人永生化角質形成細胞Bax/Bcl-2的比率,并能通過caspase依賴途徑和非caspase依賴途徑誘導人永生化角質形成細胞的凋亡[19]。本研究發(fā)現姜黃素能誘導HPF細胞的凋亡,還能下調Bcl-2的表達水平及上調Bax的表達水平。

與腫瘤有向鄰近組織侵犯的傾向相似,翼狀胬肉有自結膜逐漸向角膜中央侵犯的傾向。MMP2可通過降解Ⅳ型膠原蛋白使基底膜形成缺損進而促進細胞的遷移[20]。翼狀胬肉組織和翼狀胬肉成纖維細胞中MMP2和基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9,MMP9)的表達高于正常結膜組[21]。紫外線照射可以增強HPF細胞的移行能力,而姜黃素可以抑制紫外線照射后翼狀胬肉上皮細胞中MMP2和MMP9的表達[22-23]。本研究結果表明姜黃素能抑制HPF細胞的遷移,還能下調其MMP2的表達水平。

綜上,本研究發(fā)現姜黃素可通過抑制Cyclin D1的表達來抑制HPF細胞的增殖,通過下調Bcl-2并上調Bax的表達來誘導HPF細胞的凋亡,通過下調MMP2的表達來抑制HPF細胞的遷移,這為姜黃素成為一種臨床治療翼狀胬肉的藥物提供了一定理論依據。