王瑩,王麗,徐俊濤,肖莉

玫瑰痤瘡是一種慢性炎癥性皮膚病,全球患病率超過5%[1],其臨床特征是紅斑、毛細血管擴張、丘疹或膿皰,辛辣食物、飲料以及生理和心理刺激都可能會引發(fā)或加重該疾病[2]。玫瑰痤瘡的治療方法多種多樣,包括抗生素、類維生素A、糖皮質(zhì)激素和基于光照的療法[3]。但應(yīng)用維A酸或壬二酸可能會引起干燥和明顯的燒灼感,長期使用抗生素可能會產(chǎn)生耐藥性,口服異維A酸可誘使胎兒器官發(fā)生障礙和骨質(zhì)減少。因此,需要開發(fā)具有較少副作用的新藥物來治療玫瑰痤瘡[4]。柴胡皂苷A(saikosaponin A,SSA)是從柴胡中分離出來的具有生物活性的物質(zhì),其具有抗病毒、抗癌、保肝、免疫調(diào)節(jié)和抗炎等活性[5]。據(jù)報道,SSA通過抑制炎癥反應(yīng)來減輕特應(yīng)性皮炎小鼠皮膚損傷[6],而SSA能否減輕小鼠玫瑰痤瘡樣炎癥反應(yīng)尚不明確。相關(guān)研究顯示,抑制細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)/核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)信號通路可有效減少過度炎癥及隨后的特應(yīng)性皮炎樣病變[7]。抑制NF-κB可減輕丙酸桿菌誘導(dǎo)的痤瘡小鼠炎癥反應(yīng)[8]。表明ERK/NF-κB信號通路可能是治療炎癥性相關(guān)疾病的潛在靶點。而SSA能否通過調(diào)控ERK/NF-κB信號通路抑制玫瑰痤瘡小鼠炎癥反應(yīng)尚不清楚。因此,本研究主要探究SSA對玫瑰痤瘡小鼠炎癥反應(yīng)的影響以及其作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 84只,7周齡,體重為20～22 g的SPF雌性BALB/c小鼠獲自廣東維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,生產(chǎn)許可證號為SCXK(粵)2022-0063。本研究中進行的所有動物實驗均經(jīng)本院動物倫理委員會批準,符合有關(guān)動物護理和使用的機構(gòu)指南。

1.2主要試劑 柴胡皂苷A(規(guī)格:20 mg,純度98%)購自成都曼思特生物公司;鹽酸多西環(huán)素(doxycycline hyclate,DH)購自北京普非生物公司;重組小鼠表皮生長因子(rmEGF)購自上海淳麥生物公司;小鼠白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、S100鈣結(jié)合蛋白A9(S100 calcium binding protein A9,S100A9)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α,TNF-α)ELISA試劑盒購自上海赫果生物公司;兔源一抗血小板內(nèi)皮細胞黏附分子1(platelet endothelial cell adhesion molecule 1,CD31)、ERK1/2、NF-κB p65、p-ERK1/2、p-NF-κB p65、GAPDH及辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔二抗均購自英國Abcam公司。

1.3玫瑰痤瘡小鼠模型的構(gòu)建[9]將小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后,剃除小鼠背部3 cm×3 cm范圍處毛發(fā),并向該處注射320 μmol/L LL-37,每次注射40 μL,每隔12 h注射1次,共注射4次。

1.4動物分組及給藥 按照隨機數(shù)字表法將小鼠隨機分為Ct組、Model組、低劑量SSA組(SSA-L組)、高劑量SSA組(SSA-H組)、DH組、rmEGF組(ERK激動劑)、SSA-H+rmEGF組,每組12只。除Ct組外,其他組小鼠均需按照1.3所述方法構(gòu)建玫瑰痤瘡模型,Ct組小鼠背部注射4次等量的PBS。造模24 h后,進行給藥處理,SSA-L組、SSA-H組[10]、DH組[11]小鼠分別灌胃37.5 mg/kg SSA、75 mg/kg SSA、30 mg/kg DH,且均需尾靜脈注射等體積的生理鹽水;rmEGF組[12]小鼠需尾靜脈注射15 μg/kg rmEGF,且需灌胃等量的生理鹽水;SSA-H+rmEGF組小鼠需灌胃75 mg/kg SSA且需尾靜脈注射15 μg/kg rmEGF;Ct組、Model組小鼠均需灌胃等量的生理鹽水且尾靜脈注射等量的生理鹽水。每天給藥一次,共給藥8周。

1.5標本收集 選取每組全部大鼠進行背部注射部位皮膚紅斑面積及紅斑程度評分的測定;上述檢測結(jié)束后,處死小鼠,收集背部注射部位皮膚,分為兩部分(每部分包含6只小鼠背部注射部位皮膚),一部分固定于4%多聚甲醛中用于HE染色、甲苯胺藍染色、免疫熒光染色,另一部分凍存于-80 ℃中用于ELISA和Western blot實驗。

1.6皮膚紅斑面積及紅斑程度評分的測定 觀察各組小鼠背部注射部位皮膚皮損變化,并進行紅斑程度評分,無紅斑記為0分,隱約可見紅斑記為1分,呈現(xiàn)出邊界模糊的淡紅斑記為2分,表現(xiàn)為邊界清晰的紅斑記為3分,紅斑顏色深且邊界清晰記為4分。利用Image J軟件測定皮膚紅斑面積。

1.7HE染色檢測小鼠背部注射部位皮膚病理損傷程度 小鼠皮膚組織用4%多聚甲醛固定,石蠟包埋,切成5 μm厚的切片,然后進行HE染色,并在光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠背部注射部位皮膚病理損傷程度。

1.8甲苯胺藍染色檢測小鼠背部注射部位皮膚肥大細胞浸潤情況 小鼠皮膚組織用4%多聚甲醛固定,石蠟包埋,切成5 μm厚的切片,然后進行甲苯胺藍染色,并在光學(xué)顯微鏡下觀察呈藍紫色的肥大細胞數(shù)變化。

1.9免疫熒光染色檢測CD31表達 將組織切片用檸檬酸處理用于抗原修復(fù),并與一抗CD31在4 ℃孵育過夜。然后將組織切片與Alexa Fluor?488標記的二抗在室溫下放置40 min。使用熒光顯微鏡捕獲圖像并使用Image J分析軟件進行分析。其中DAPI 用于染色細胞核,CD31用于標記血管內(nèi)皮細胞。

1.10ELISA實驗檢測IL-6、S100A9、TNF-α表達 嚴格按照試劑盒說明書檢測小鼠背部注射部位皮膚中IL-6、S100A9、TNF-α表達。

1.11Western blot實驗檢測p-ERK1/2、p-NF-κB p65蛋白表達 使用RIPA裂解緩沖液從小鼠背部注射部位皮膚勻漿中分離總蛋白質(zhì),將蛋白質(zhì)進行定量、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后,將膜與一抗ERK1/2(1∶1 000)、NF-κB p65(1∶2 000)、p-ERK1/2(1∶2 000)、p-NF-κB p65(1∶2 000)、GAPDH(1∶1 000)在4 ℃下過夜孵育,用二抗洗滌膜并在室溫下孵育2 h。洗滌后,使用ECL試劑對膜進行顯影。通過Image J軟件分析蛋白灰度值。

2 結(jié)果

2.1SSA對各組小鼠背部注射部位皮膚紅斑面積及紅斑程度評分的影響 Ct組小鼠背部注射部位皮膚正常;Model組小鼠背部注射部位皮膚表現(xiàn)出明顯的紅斑。與Ct組比較,Model組紅斑面積及紅斑程度評分升高(LSD-t=44.94、88.76,P<0.05);與Model組比較,SSA-L組、SSA-H組、DH組小鼠背部注射部位皮膚紅斑有所改善,紅斑面積及紅斑程度評分降低(LSD-t=13.68、34.20、35.17;18.78、64.01、64.58,P<0.05),rmEGF組小鼠背部注射部位皮膚紅斑嚴重,紅斑面積及紅斑程度評分升高(LSD-t=15.63、22.76,P<0.05);與SSA-H組比較,SSA-H+rmEGF組小鼠背部注射部位皮膚紅斑嚴重,紅斑面積及紅斑程度評分升高(LSD-t=13.68、29.02,P<0.05),見圖1和表1。

圖1 各組小鼠背部注射部位皮膚損傷情況

表1 SSA對各組小鼠背部注射部位皮膚紅斑面積及紅斑程度評分的影響

2.2SSA對各組小鼠背部注射部位皮膚病理損傷的影響 Ct組小鼠皮膚組織結(jié)構(gòu)正常,無炎性細胞浸潤;Model組小鼠皮膚屏障受損,表皮破潰,表層有大量炎性滲出細胞;與Model組比較,SSA-L組、SSA-H組、DH組小鼠皮膚組織病理損傷減輕,rmEGF組小鼠皮損更為嚴重,深層結(jié)締組織有損傷;與SSA-H組比較,SSA-H+rmEGF組小鼠皮膚組織病理損傷加劇,見圖2。

2.3SSA對各組小鼠背部注射部位皮膚肥大細胞浸潤的影響 與Ct組(1.25±0.02)個/視野比較,Model組肥大細胞數(shù)(12.27±1.05)個/視野增多(LSD-t=28.66,P<0.05);與Model組比較,SSA-L組、SSA-H組、DH組肥大細胞數(shù)(9.13±0.72)個/視野、(3.62±0.15)個/視野、(3.57±0.14)個/視野減少(LSD-t=8.17、22.50、22.63,P<0.05),rmEGF組(16.69±1.18)個/視野增多(LSD-t=11.50,P<0.05);與SSA-H組比較,SSA-H+rmEGF組肥大細胞數(shù)(6.78±0.22)個/視野增多(LSD-t=8.22,P<0.05),見圖3。

圖3 甲苯胺藍染色檢測小鼠背部注射部位皮膚肥大細胞浸潤情況 (×200)

2.4SSA對各組小鼠背部注射部位皮膚中毛細血管分布的影響 與Ct組(12.22±1.05)個/視野比較,Model組CD31陽性毛細血管數(shù)(33.36±1.57)個/視野增多,且呈現(xiàn)出明顯的擴張狀態(tài)(LSD-t=27.39,P<0.05);與Model組比較,SSA-L組、SSA-H組、DH組CD31陽性毛細血管數(shù)(26.67±1.21)個/視野、(15.59±1.24)個/視野、(15.63±1.18)個/視野減少(LSD-t=8.67、23.02、22.97,P<0.05),毛細血管變細,rmEGF組(38.82±1.66)個/視野增多,且表現(xiàn)出擴張狀態(tài)(LSD-t=7.07,P<0.05);與SSA-H組比較,SSA-H+rmEGF組CD31陽性毛細血管數(shù)(21.15±1.34)個/視野增多,毛細血管擴張(LSD-t=7.20,P<0.05),見圖4。

2.5SSA對各組小鼠背部注射部位皮膚中炎性因子IL-6、S100A9、TNF-α表達的影響 與Ct組比較,Model組IL-6、S100A9、TNF-α表達升高(LSD-t=25.30、20.88、20.68,P<0.05);與Model組比較,SSA-L組、SSA-H組、DH組IL-6(LSD-t=8.17、22.36、22.49,P<0.05)、S100A9(LSD-t=7.40、17.28、17.57,P<0.05)、TNF-α(LSD-t=6.40、18.65、18.72,P<0.05)表達均降低,rmEGF組IL-6、S100A9、TNF-α表達升高(LSD-t=9.03、13.53、8.62,P<0.05);與SSA-H組比較,SSA-H+rmEGF組IL-6、S100A9、TNF-α表達升高(LSD-t=6.26、6.20、7.73,P<0.05),見圖5。

圖4 免疫熒光染色檢測小鼠背部注射部位皮膚中CD31的表達 (×200)

Note: Compared with Ct group,aP<0.05; compared with Model group, bP<0.05; compared with SSA-L group, cP<0.05; compared with SSA-H group, dP<0.05.

2.6SSA對各組小鼠背部注射部位皮膚中ERK/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達的影響 與Ct組比較,Model組p-ERK1/2、p-NF-κB p65蛋白表達升高(LSD-t=21.65、28.45,P<0.05);與Model組比較,SSA-L組、SSA-H組、DH組p-ERK1/2、p-NF-κB p65蛋白表達降低(LSD-t=5.20、17.75、18.62;10.39、24.38、23.93,P<0.05),rmEGF組p-ERK1/2、p-NF-κB p65蛋白表達升高(LSD-t=5.20、5.87,P<0.05);與SSA-H組比較,SSA-H+rmEGF組p-ERK1/2、p-NF-κB p65蛋白表達升高(LSD-t=8.66、10.39,P<0.05),見圖6。

Note:1 indicated Ct; 2 indicated Model; 3 indicated SSA-L; 4 indicated SSA-H; 5 indicated DH; 6 indicated rmEGF; 7 indicated SSA-H+rmEGF; compared with Ct group,aP<0.05; compared with Model group, bP<0.05; compared with SSA-L group, cP<0.05; compared with SSA-H group, dP<0.05.

3 討論

玫瑰痤瘡是臨床常見的慢性炎癥性皮膚病,其影響全球約5.5%的人口,并可能導(dǎo)致毀容、影響情緒和生活質(zhì)量下降等[13]。傳統(tǒng)的玫瑰痤瘡治療方法,如抗生素、類維生素A等均不能取得滿意的療效[14]?？咕腖L37因其在玫瑰痤瘡患者皮膚和LL37誘導(dǎo)的玫瑰痤瘡表型的小鼠模型中的高表達而被認為是玫瑰痤瘡發(fā)生的一種關(guān)鍵分子,并且已被廣泛接受的是,可以進行皮內(nèi)注射LL37以建立玫瑰痤瘡小鼠模型[15-16]。本研究利用上述方式構(gòu)建玫瑰痤瘡小鼠模型,結(jié)果顯示,Model組小鼠背部注射部位皮膚表現(xiàn)出明顯的紅斑表型,與Ct 組比較,Model組紅斑面積及紅斑程度評分升高,提示玫瑰痤瘡小鼠模型構(gòu)建成功。S100A9作為一種關(guān)鍵的炎癥介質(zhì),其在玫瑰痤瘡中上調(diào)表達[13];IL-6、TNF-α作為常見用于衡量機體炎癥水平的因子,已有研究表明,抑制IL-6、TNF-α表達可減弱玫瑰痤瘡樣表型和炎癥反應(yīng)[17]。本研究顯示,Model組小鼠皮膚組織增厚,有大量炎性細胞、肥大細胞浸潤,表明Model組小鼠炎癥反應(yīng)加劇。盡管玫瑰痤瘡的病理生理學(xué)機制尚不清楚,但多種因素,如新血管生成增加與其發(fā)病機制有關(guān)[18]。本研究顯示,與Ct組比較,Model組血管生成的關(guān)鍵標志物CD31陽性毛細血管數(shù)增多,且呈現(xiàn)出明顯的擴張狀態(tài),表明Model組小鼠存在毛細血管擴張及增多現(xiàn)象。提示LL37進入表皮后,引起了IL-6、S100A9、TNF-α等炎性因子增多,激活了肥大細胞,長期的炎性刺激導(dǎo)致了毛細血管的增生與擴張,進而加劇了皮膚的炎癥反應(yīng)。因此,抑制炎癥反應(yīng)及血管生成可能是治療玫瑰痤瘡的有效策略之一。

SSA是柴胡最有效的成分之一,具有較強的抗炎作用[19]。據(jù)報道,SSA可抑制大鼠急性脊髓損傷早期組織和血清中TNF-α、IL-6水平[20];SSA可改善過敏性鼻炎小鼠鼻部炎癥[21];SSA通過抑制腫瘤血管生成來抑制結(jié)直腸腫瘤的生長[22];SSA可抑制坐骨神經(jīng)損傷大鼠炎癥反應(yīng)及瘢痕形成[23]。以上研究表明SSA具有抑制炎癥反應(yīng)及血管生成的作用。而關(guān)于SSA對玫瑰痤瘡小鼠炎癥反應(yīng)及血管生成的影響尚未見報道。本研究顯示,SSA可抑制玫瑰痤瘡小鼠炎癥反應(yīng)、毛細血管增生及擴張,且SSA劑量越高,抑制作用越明顯。鹽酸多西環(huán)素(DH)是臨床上治療玫瑰痤瘡常用藥物[24],本研究選擇此藥物為陽性治療藥物,結(jié)果發(fā)現(xiàn),SSA-H組與DH組比較,對應(yīng)指標變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義,提示SSA可能是玫瑰痤瘡的潛在治療藥物。

激活的ERK1/2通過激活NF-κB來刺激細胞分泌炎性細胞因子進而加重機體的炎癥反應(yīng)[25]。已有研究表明,抑制ERK/NF-κB通路可減輕慢性腎臟病大鼠腎臟炎性細胞浸潤[26];抑制ERK/NF-κB通路可抑制膠質(zhì)母細胞瘤形成過程中的血管生成[27];激活NF-κB可促進玫瑰痤瘡的發(fā)生與發(fā)展[28]。以上研究證實了ERK/NF-κB通路的促炎及促血管生成作用,該通路可能成為治療玫瑰痤瘡的關(guān)鍵突破口之一,本研究結(jié)果與其一致。本研究發(fā)現(xiàn),與Ct 組比較,Model組p-ERK1/2、p-NF-κB p65蛋白表達升高;與Model組比較,rmEGF組p-ERK1/2、p-NF-κB p65蛋白表達升高,提示ERK/NF-κB通路可能參與了玫瑰痤瘡小鼠炎癥反應(yīng)、毛細血管增生及擴張過程。SSA可降低玫瑰痤瘡小鼠皮膚中p-ERK1/2、p-NF-κB p65蛋白的表達,且SSA劑量越高,降低作用越明顯,提示SSA可能通過抑制ERK/NF-κB通路減輕玫瑰痤瘡小鼠炎癥反應(yīng)。為了驗證該猜想,本研究在高劑量SSA作用的基礎(chǔ)上再加上ERK激動劑rmEGF處理Model組小鼠,結(jié)果顯示,rmEGF減弱了高劑量SSA對玫瑰痤瘡小鼠炎癥反應(yīng)的抑制作用。證實猜想是正確的,即SSA可能通過抑制ERK/NF-κB通路減輕玫瑰痤瘡小鼠炎癥反應(yīng)。

綜上所述,SSA可能通過抑制ERK/NF-κB通路減輕玫瑰痤瘡小鼠炎癥反應(yīng)。該研究結(jié)果強調(diào)了SSA可作為LL37誘導(dǎo)的皮膚炎癥疾病的有前途的藥物。然而,本研究尚存在不足之處,SSA對玫瑰痤瘡小鼠炎癥反應(yīng)的抑制作用可能還涉及其他通路,本研究尚未涉及,這將是后續(xù)研究的重點。