毛漢瀟,劉汝蘭,譚自敏,譚小琦,熊霞,何淵民

成纖維細(xì)胞是人真皮中主要細(xì)胞,在長(zhǎng)波紫外線(xiàn)(ultraviolet A, UVA)照射下容易發(fā)生各類(lèi)損傷,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡及多種皮膚疾病發(fā)生[1],但具體機(jī)制不清。自噬是一種溶酶體依賴(lài)的細(xì)胞降解細(xì)胞器和大分子物質(zhì)的過(guò)程,可有效維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)[2]。既往研究[3]發(fā)現(xiàn),細(xì)胞自噬與凋亡的關(guān)系密切,多種外源因素可通過(guò)不同的機(jī)制上調(diào)細(xì)胞自噬水平,參與調(diào)控細(xì)胞凋亡,如胞外營(yíng)養(yǎng)成分發(fā)生變化可通過(guò)IGF-I/PI3K/mTOR/S6K上調(diào)細(xì)胞自噬,參與調(diào)控如心肌細(xì)胞來(lái)源的H9c2細(xì)胞、人肝癌細(xì)胞等細(xì)胞凋亡[4]。還有研究[5]發(fā)現(xiàn),UVA照射可誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激,激活自噬;抑制紫外線(xiàn)誘導(dǎo)的自噬可以引起細(xì)胞凋亡增加。但至今UVA誘導(dǎo)的自噬與細(xì)胞凋亡的具體關(guān)系及調(diào)控機(jī)制仍不清楚。在本研究中,筆者擬分析UVA誘導(dǎo)人真皮成纖維細(xì)胞凋亡中自噬的作用及可能的調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 人皮膚成纖維細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù));胎牛血清(四季青公司);青霉素-鏈霉素溶液(×100)、CCK-8試劑盒(碧云天公司);雷帕霉素(RAPA)、ML385溶液(中國(guó)MCE公司);FITC Annexin V/PI凋亡試劑盒(美國(guó)BD公司);Nrf2 siRNA(美國(guó)Dhsrmacon公司);DCFH-DA探針(美國(guó)Sigma公司);SUV-1000日光紫外線(xiàn)模擬器(中國(guó)上海希格瑪有限公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與建模 在37 ℃含5% 的CO2孵箱內(nèi),將人皮膚成纖維細(xì)胞置于含有10%胎牛血清1%青鏈霉素雙抗高糖DEME培養(yǎng)基中培養(yǎng);待生長(zhǎng)良好后均勻接種于6孔板中培養(yǎng),將6孔板于冰上用紫外線(xiàn)模擬器以8 J/cm2的UVA進(jìn)行照射,照射結(jié)束后置于孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2細(xì)胞分組處理 細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、UVA組、雷帕霉素(RAPA)組、3-甲基嘌呤(3-MA)組、ML385組和Nrf2 siRNA干擾(siRNA)組。RAPA組和3-MA組分別加入稀釋后的母液100 nmol/L和50 μmmol/L。除對(duì)照組外,其余各組經(jīng)不同試劑預(yù)處理2 h后用紫外線(xiàn)模擬器以8 J/cm2的UVA進(jìn)行照光處理。

1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 siRNA片段成纖維細(xì)胞接種于含無(wú)抗培養(yǎng)基的24孔板中,待細(xì)胞密度達(dá)80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染步驟按試劑盒說(shuō)明操作。

1.2.4細(xì)胞活性檢測(cè) 細(xì)胞經(jīng)消化、離心后,將細(xì)胞懸液密度重調(diào)為2×104個(gè)/mL時(shí)將細(xì)胞接種于96孔板中,分別于每孔中加入10 μL CCK-8溶液后于酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm處的吸光值。

1.2.5細(xì)胞凋亡檢測(cè) 各組細(xì)胞經(jīng)光照造模處理后,經(jīng)消化、離心后,采用Annexin V-FITC/PI染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.2.6Western blot檢測(cè) 各組細(xì)胞經(jīng)使用裂解液刮取細(xì)胞,離心,收集上清液并用BCA法測(cè)定目標(biāo)蛋白的濃度。進(jìn)行蛋白電泳,隨后通過(guò)濕法轉(zhuǎn)膜。5%脫脂牛奶中室溫封閉2 h后孵育一抗4 ℃過(guò)夜,用TBST液體清洗后室溫孵育二抗1 h。顯影曝光,采集圖像并灰度分析。

2 結(jié)果

2.1UVA誘導(dǎo)人皮膚成纖維細(xì)胞凋亡 與未照射組(0 h)相比,成纖維細(xì)胞經(jīng)8 J/cm2劑量的UVA光照4 h后細(xì)胞形態(tài)變化最大。CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示,成纖維細(xì)胞經(jīng)UVA照射時(shí)間延長(zhǎng)細(xì)胞活性逐漸降低,組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=93.182,P<0.01)。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,隨著照射時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞凋亡比例增高(F=37.484,P<0.01),見(jiàn)圖1。

2.2UVA誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞自噬水平變化及對(duì)凋亡的影響 除對(duì)照組外,以8 J/cm2UVA照射UVA組、RAPA組及3-MA組后,CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示,細(xì)胞活性從高到低的順序依次是對(duì)照組、RAPA組、UVA組、3-MA組,組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=66.826,

P<0.01)。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,自噬促進(jìn)劑RAPA預(yù)處理細(xì)胞后,細(xì)胞凋亡率顯著低于UVA組(P<0.01);而自噬抑制劑3-MA預(yù)處理細(xì)胞后,細(xì)胞凋亡比例顯著高于其他各組(P<0.01),各組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=88.654,P<0.01)。Western blot檢測(cè)各組成纖維細(xì)胞中的自噬關(guān)鍵分子LC3、p62及細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Cleaved Caspase3的表達(dá)變化情況,結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,細(xì)胞經(jīng)UVA照射后LC3Ⅱ/Ⅰ比值增大、p62表達(dá)降低,Cleaved Caspase3表達(dá)顯著增加;而RAPA組較UVA組的LC3Ⅱ/Ⅰ比值增大、p62減少,胞內(nèi)Cleaved Caspase3表達(dá)顯著降低;3-MA組較UVA組的LC3Ⅱ/Ⅰ比值減小、p62增多,Cleaved Caspase3表達(dá)明顯升高。LC3Ⅱ/Ⅰ比值、p62及Cleaved Caspase3在4組中的比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=35.570、191.844、77.857,P<0.01),見(jiàn)圖2。

Note:Compared with control group, *P<0.05, **P<0.01; compared with UVA group,△P<0.05,△△P<0.01.

2.3Nrf2信號(hào)通路調(diào)控自噬參與UVA誘導(dǎo)的人皮膚成纖維細(xì)胞凋亡 與對(duì)照組相比,UVA組胞核內(nèi)Nrf2的表達(dá)明顯增多;Nrf2抑制劑處理后的ML385組胞核內(nèi)Nrf2的表達(dá)降低,并且胞漿LC3Ⅱ/Ⅰ降低、p62蛋白減少,Cleaved Caspase3蛋白增加,Nrf2、LC3Ⅱ/Ⅰ比值、p62及Cleaved Caspase3在3組中的比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=86.366、55.815、172.715、137.363,P<0.01)。使用Nrf2 siRNA干預(yù)Nrf2表達(dá)后,觀察到了與Nrf2抑制劑處理相似的結(jié)果,即胞漿p62蛋白、LC3Ⅱ/Ⅰ減少,Cleaved Caspase3蛋白增加(F=425.029、57.871、412.902,P<0.01),見(jiàn)圖3～4。

3 討論

紫外線(xiàn)輻射可以引起皮膚損傷,紫外線(xiàn)中95%為UVA,可到達(dá)皮膚真皮層,誘導(dǎo)真皮中主要成分成纖維細(xì)胞損傷[6],該過(guò)程與皮膚老化和損傷后修復(fù)息息相關(guān)[7],目前國(guó)內(nèi)外對(duì)UVA引起成纖維細(xì)胞自噬和凋亡的研究較少,明確UVA對(duì)成纖維細(xì)胞損傷機(jī)制對(duì)于減緩成纖維細(xì)胞的光損傷甚至逆轉(zhuǎn)細(xì)胞結(jié)局有重要價(jià)值。在本研究中觀察到以8 J/cm2UVA照射成纖維細(xì)胞后,細(xì)胞凋亡增加、活性下降。有研究[8]表明,UVA照射可增加凋亡轉(zhuǎn)錄因子的產(chǎn)生促進(jìn)凋亡發(fā)生,其對(duì)成纖維細(xì)胞的凋亡作用具有劑量依賴(lài)性,劑量越大,細(xì)胞凋亡率越高,如侯巍等[9]在研究中發(fā)現(xiàn),UVA≤10 J/cm2照射時(shí)成纖維細(xì)胞的凋亡率不高于15%,劑量≥20 J/cm2時(shí)細(xì)胞凋亡率已達(dá)50%左右。在相同UVA劑量照射下,Godar等[10]在UVA照射成纖維細(xì)胞后分別分離凋亡DNA,在2 h時(shí)發(fā)現(xiàn)第一梯度出現(xiàn),4 h時(shí)出現(xiàn)“梯化現(xiàn)象”,8 h及之后時(shí)間與4 h相比沒(méi)有明顯增加,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)可能與UVA損傷細(xì)胞DNA和下調(diào)Bcl-2的作用時(shí)間相關(guān)[11]。

生理狀態(tài)下,細(xì)胞自噬是細(xì)胞的自我防御與修復(fù)過(guò)程,對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)十分重要[12-13],目前國(guó)內(nèi)外許多亞領(lǐng)域?qū)W者致力于探究自噬的相關(guān)機(jī)制為衰老[14]、退行性變[15]等疾病提供新思路。氧

Note:Compared with control group, *P<0.05, **P<0.01; compared with UVA group,△P<0.05,△△P<0.01.

Note:Compared with control group, *P<0.05, **P<0.01; compared with UVA group,△P<0.05,△△P<0.01.

化應(yīng)激與自噬激活密切相關(guān)[16-17],有研究表明[8],UVA照射可激活自噬保護(hù)細(xì)胞,以減少紫外線(xiàn)對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的損害。在本研究中,筆者觀察到成纖維細(xì)胞經(jīng)UVA照射后,LC3Ⅱ/Ⅰ比值增加,p62含量下降,表明UVA照射可上調(diào)成纖維細(xì)胞自噬水平。既往研究[18]發(fā)現(xiàn),在細(xì)胞處于應(yīng)激時(shí)胞內(nèi)自噬水平會(huì)升高,以降解損傷的細(xì)胞器和凋亡相關(guān)蛋白抑制凋亡;也有報(bào)道[19]發(fā)現(xiàn)當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)高水平自噬可以促進(jìn)凋亡。本實(shí)驗(yàn)使用3-MA抑制自噬后,用同等劑量的UVA照射成纖維細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Cleaved Caspase3明顯增加;使用RAPA促進(jìn)自噬后,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Cleaved Caspase3顯著下降。結(jié)果表明UVA照射后促進(jìn)成纖維細(xì)胞自噬可以顯著抑制細(xì)胞凋亡。

研究[20]發(fā)現(xiàn),UVA照射后細(xì)胞內(nèi)Nrf2及其下游信號(hào)可被激活,Nrf2通路與氧化應(yīng)激相關(guān),還有研究[21]也指出Nrf2通路對(duì)細(xì)胞自噬和凋亡均有調(diào)節(jié)作用。Hirota等[22]研究發(fā)現(xiàn),敲除Nrf2基因后,成纖維細(xì)胞經(jīng)UVA照射其細(xì)胞凋亡數(shù)明顯增加。在本實(shí)驗(yàn)證明UVA照射成纖維細(xì)胞后可誘導(dǎo)Nrf2入核,采用Nrf2抑制劑ML385阻斷Nrf2入核及使用siRNA抑制Nrf2表達(dá)后,此時(shí)的p62表達(dá)較UVA組下降,表明Nrf2核轉(zhuǎn)位可以調(diào)控p62的表達(dá),這一結(jié)果提示p62可能是Nrf2信號(hào)的下游分子;此外,筆者發(fā)現(xiàn)抑制Nrf2入核后UVA照射成纖維細(xì)胞時(shí)Cleaved Caspase3蛋白含量較UVA組增加,證明Nrf2核轉(zhuǎn)位可以抑制UVA照射后成纖維細(xì)胞的凋亡,但是UVA照射后激活Nrf2入核誘導(dǎo)自噬調(diào)控成纖維細(xì)胞凋亡的完整過(guò)程及調(diào)控仍然有待深入研究。綜上,筆者的研究發(fā)現(xiàn),UVA照射可以激活Nrf2/p62信號(hào)通路上調(diào)細(xì)胞自噬水平,細(xì)胞自噬可以抑制UVA誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果可能為光損傷性皮膚病的發(fā)病及治療提供新方向,但未來(lái)尚需對(duì)Nrf2信號(hào)通路在UVA致成纖維細(xì)胞凋亡過(guò)程進(jìn)行深入研究以更好的闡明Nrf2-自噬軸對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用。