王金鳳，江榮松，艾尼娃爾·艾克木, ，張偉怡*

（1. 新疆醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011；2. 新疆維吾爾醫(yī)學(xué)?？茖W(xué)校，新疆 和田 843000）

慢性粒細(xì)胞白血病（chronic myeloid leukemia，CML）起源于髓系祖細(xì)胞，其特點(diǎn)是異常的造血祖細(xì)胞不受控制的增殖，是一種罕見的骨髓增生性腫瘤[1-2]。其特征是9號染色體上的ABL1基因和22號染色體上的BCR基因融合形成融合基因BCRABL，由其編碼的BCR/ABL融合蛋白可持續(xù)增強(qiáng)酪氨酸激酶的活性[3-4]，進(jìn)一步激活下游增殖、分化等相關(guān)信號通路，引起疾病的惡化，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。隨著酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKI）在國內(nèi)廣泛應(yīng)用，極大改善了CML的治療效果，患者生存時(shí)間和生活質(zhì)量都得到了明顯改善，10年生存率由20 %左右提高到80 %～90 %[5]。但仍有20 %～30 %的患者存在原發(fā)藥物反應(yīng)不良或出現(xiàn)繼發(fā)耐藥[6-8]。

紫蘇醛（perillaldehyde，PAE）是從紫蘇[Perilla frutescens(L.)Britt.][9]中提取的主要活性成分之一，可作為食品添加劑，也是生產(chǎn)香精和香水的主要原料[10]。由于良好的抗氧化活性，可作為有機(jī)水果和食品保鮮劑[11]。藥理研究表明，PAE具有較強(qiáng)的抗腫瘤[12-13]、抗抑郁[14]、抗炎[15-16]等多種藥理作用。然而，PAE在治療CML中的作用尚未見報(bào)道。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接方法，以PAE為研究對象，預(yù)測分析抗CML的潛在靶點(diǎn)，借助GEO數(shù)據(jù)庫分析CML患者和健康人群的差異基因，并通過體外試驗(yàn)加以驗(yàn)證。

1 儀器與材料

1.1 儀器

VD-650超凈工作臺（上海尚道）；Infinite-EPlex全波長酶標(biāo)儀（Tecan Trading公司）；BKQZ75I立式壓力蒸汽滅菌器（山東博科）；37XB倒置顯微鏡（上海豫光）；PowerPac Basic凝膠電泳儀（美國Bio-Rad公司）；690BR031901半干轉(zhuǎn)電轉(zhuǎn)儀（美國Bio-Rad公司）；EDGE V.070化學(xué)發(fā)光成像儀（法國Vilber公司）。

1.2 材料

紫蘇醛（純度≥98 %，Solarbio）；二甲基亞砜（DMSO，Solarbio）；蛋白裂解液（RIPA，Solarbio）；苯甲基磺酰氟（PMSF，Solarbio）；蛋白上樣緩沖液（Solarbio）；脫脂奶粉（Solarbio）； IMDM基礎(chǔ)培養(yǎng)基（Procell）；磷酸鹽緩沖溶液（PBS，Servicebio）；胎牛血清（FBS，Biological Industries）；青霉素和鏈霉素混合液（Biological Industries）；胰蛋白酶（VivaCell）；蛋白定量試劑盒（Biosharp）；聚偏氟乙烯（PVDF）膜（Millipore）；ECL發(fā)光試劑盒（Millipore）；白介素8（IL-8）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；IL-8抗體（Abcam）；β-actin抗體（Bioss）；羊抗鼠HRP二抗（Bioss）。

1.3 數(shù)據(jù)庫

采用的數(shù)據(jù)庫及其網(wǎng)址信息見表1。

表1 數(shù)據(jù)庫

2 方法

2.1 藥物靶點(diǎn)獲取

通過檢索HERB（http://herb.ac.cn）、BATMAN（http://bionet.ncpsb.org.cn）、TCMSP（https://old.tcmsp-e.com）、SuperPred（https://prediction.charite.de/）數(shù)據(jù)庫分別獲取PAE的作用靶點(diǎn)。

2.2 疾病靶點(diǎn)獲取

通過檢索Genecards（https://www.genecards.org/）、DisGeNET （https://www.disgenet.org/search）、DrugBank （http://www.drugbank.ca）和OMIM （http://www.omim.org）數(shù)據(jù)庫預(yù)測CML的相關(guān)疾病靶點(diǎn)。

2.3 PAE-CML交集靶點(diǎn)篩選

對上述獲得的藥物靶點(diǎn)、疾病靶點(diǎn)使用R包（VennDiagram，version 1.7.3）獲得交集基因并制作韋恩圖，得到PAE抗CML的潛在靶點(diǎn)。

2.4 富集分析

將上述獲得交集基因使用R包（clusterProfiler，version 4.4.1）進(jìn)行基于GO及KEGG的富集分析，并使用enrichplot包（version 1.16.0）繪制條形圖及氣泡圖。

2.5 交集靶點(diǎn)-功能-通路的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖

使用Cytoscape（version 3.8.2）利用GO富集的交集靶點(diǎn)構(gòu)建交集靶點(diǎn)-功能的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖；利用KEGG途徑富集的交集靶點(diǎn)構(gòu)建交集靶點(diǎn)-通路的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖。

2.6 交集靶點(diǎn)的PPI調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖

將潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING（https://string-db.org）數(shù)據(jù)庫，以置信度為0.4（Confidence=0.4）作為篩選條件構(gòu)建蛋白互相作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)。其中節(jié)點(diǎn)代表靶點(diǎn)蛋白，邊代表蛋白相互作用。

2.7 分子對接

選擇交集靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)中degree最高的蛋白，與PAE進(jìn)行分子對接。從PDB（https://www.rcsb.org/）數(shù)據(jù)庫中下載靶點(diǎn)對應(yīng)的蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)，再從TCMSP數(shù)據(jù)庫下載活性成分的三維結(jié)構(gòu)，利用AutoDockvina進(jìn)行分子對接。通常對接結(jié)合能小于-1.2 kcal/mol時(shí)，證明配體與受體可較好結(jié)合。

2.8 生物信息學(xué)分析

對GEO（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）數(shù)據(jù)庫中的GSE138883[17]和GSE5550[18]數(shù)據(jù)集進(jìn)行整合分析，使用R包（limma：3.40.2）研究mRNA的差異表達(dá)。在GEO中分析調(diào)整后的P值以糾正假陽性結(jié)果并繪制火山圖。運(yùn)用R軟件包pheatmap繪制表達(dá)熱圖。通過boxplot繪制正常組與CML患者組差異基因表達(dá)箱線圖。

2.9 酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）

取對數(shù)生長期K562細(xì)胞，以4.0×105個(gè)/孔鋪于6孔板。實(shí)驗(yàn)組分別加入200 μl紫蘇醛使其終濃度為0，25，50，100，200 μmol/L，空白對照組加入等體積的PBS，5 % CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。使用人白介素8（IL-8）ELISA試劑盒測定細(xì)胞上清中CXCL8（又稱IL-8）的含量。

2.10 蛋白質(zhì)印跡（Western blot）檢測

細(xì)胞按2.9項(xiàng)下方法給藥干預(yù)。收集細(xì)胞，1000 r/min離心5 min，用PBS清洗細(xì)胞兩次，離心棄上清后每組加入裂解液（RIPA:PMSF=100:1）150 μl，轉(zhuǎn)移至1.5 ml EP管，冰上靜置裂解15 min，12 000 r/min，4 ℃離心15 min，取上清，轉(zhuǎn)移至新的1.5 ml EP管中備用。制備15 %分離膠和5 %濃縮膠。將其固定于電泳槽上，槽內(nèi)裝滿1×電泳緩沖液，按空白對照，0，25，50，100，200 μmol/L順序每孔上樣10 μl。電泳電壓設(shè)置為80 V，待分子量標(biāo)記物（marker）明顯分開后再將電壓設(shè)置為120 V，直至藍(lán)色指示條帶靠近玻璃板底部結(jié)束。裁剪尺寸合適的PVDF膜，提前使用甲醇活化5 min使其被激活，取下玻璃板裁剪含蛋白的凝膠部分，按濾紙、PVDF膜、凝膠、濾紙順序壓緊，置于半干轉(zhuǎn)儀中，確保每層都不留下氣泡，設(shè)置電流為0.5 A，電轉(zhuǎn)35 min。使用5 %脫脂奶粉封閉2 h，加入IL-8抗體（1:500）或內(nèi)參（β-actin）抗體（1:2000），4 ℃搖床孵育過夜。TBST洗滌5次，加入二抗，室溫孵育（1:2000）1 h，TBST洗滌5次，將PVDF膜在發(fā)光液中浸潤后使用曝光儀進(jìn)行曝光，保存圖片并進(jìn)行定量分析。

3 結(jié)果

3.1 藥物靶點(diǎn)獲取結(jié)果

HERB、BATMAN、TCMSP和SuperPred數(shù)據(jù)庫分別預(yù)測得到10，30，7，8個(gè)可能作用的靶點(diǎn)，合并4個(gè)數(shù)據(jù)庫得到的藥物靶點(diǎn)，最終共得到53個(gè)藥物靶點(diǎn)。

3.2 疾病靶點(diǎn)獲取結(jié)果

在Genecards數(shù)據(jù)庫中以相關(guān)分?jǐn)?shù)（relevance score）≥7獲得1178個(gè)疾病靶點(diǎn)，在DisGeNET、DrugBank及OMIM數(shù)據(jù)庫中分別獲得1234個(gè)、6個(gè)及1個(gè)靶點(diǎn)，合并4個(gè)數(shù)據(jù)庫得到的疾病靶點(diǎn)，最終共得到2415個(gè)疾病靶點(diǎn)。

3.3 PAE-CML交集靶點(diǎn)篩選

將上述獲得的藥物靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)運(yùn)用R包（VennDiagram，version 1.7.3）繪圖取得交集，共獲得18個(gè)交集靶點(diǎn)，見圖1。

圖1 PAE藥物靶點(diǎn)與CML疾病靶點(diǎn)Venn圖

3.4 富集分析

GO共富集到193條GO相關(guān)通路（調(diào)整后P＜0.05），其中GO-BP目錄156個(gè)，GO-CC目錄0個(gè)，GO-MF目錄37個(gè)，主要包括對類固醇激素的反應(yīng)、細(xì)胞對類固醇激素刺激的反應(yīng)、血管相關(guān)平滑肌收縮的調(diào)節(jié)等，見圖2。KEGG富集到18條通路（調(diào)整后P＜0.05），主要包括NOD樣受體信號通路（NOD-like receptor signaling pathway）、趨化因子信號通路、脂質(zhì)與動脈粥樣硬化等，見圖3。

圖2 PAE抗CML交集靶點(diǎn)GO分析

圖3 PAE抗CML交集靶點(diǎn)KEGG分析

3.5 交集靶點(diǎn)-功能-通路的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖

使用Cytoscape（version 3.8.2）將GO（GOBP、GO-CC和GO-MF）富集結(jié)果按P值從小到大排序，分別取排名靠前的15個(gè)交集靶點(diǎn)構(gòu)建交集靶點(diǎn)-功能調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖，網(wǎng)絡(luò)中包含30個(gè)GO關(guān)系項(xiàng)（term），15個(gè)交集靶點(diǎn)，共106個(gè)關(guān)系對，見圖4。使用Cytoscape（version 3.8.2）將KEGG富集結(jié)果按P值從小到大排序，構(gòu)建了交集靶點(diǎn)-通路的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖，網(wǎng)絡(luò)包含18條KEGG途徑，8個(gè)交集靶點(diǎn)，共54個(gè)關(guān)系對，見圖5。

圖4 PAE和CML交集靶點(diǎn)-功能的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖

圖5 PAE和CML交集靶點(diǎn)-通路的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖

3.6 交集靶點(diǎn)的PPI調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖

為了探究這18個(gè)交集靶點(diǎn)之間是否存在互相作用關(guān)系，將其導(dǎo)入到STRING（https://string-db.org）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，得到14個(gè)蛋白的互作網(wǎng)關(guān)系，包括14個(gè)節(jié)點(diǎn)，31條邊，根據(jù)節(jié)點(diǎn)大小和顏色深度反應(yīng)其連接度（degree）大小，見圖6。

圖6 PAE和CML交集靶點(diǎn)PPI調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖

3.7 分子對接

PPI網(wǎng)絡(luò)中連接度（degree）最高的靶點(diǎn)CXCL8與PAE進(jìn)行分子對接，結(jié)果表明，ARG-47殘基與PAE之間存在氫鍵相互作用，對接親和力為-5.2 kcal/mol，見圖7。

圖7 蛋白質(zhì)分子對接構(gòu)象圖

3.8 生物信息學(xué)分析

對GSE138883與GSE5550數(shù)據(jù)集整理合并得到14例正常樣本和15例CML患者樣本，對合并后的數(shù)據(jù)進(jìn)行基因差異表達(dá)分析，得到其上調(diào)及下調(diào)基因，見圖8。熱圖中明顯觀察到正常組和CML組之間有多個(gè)基因有表達(dá)差異，見圖9。再對CXCL8單獨(dú)進(jìn)行表達(dá)差異比較，發(fā)現(xiàn)CXCL8在正常組和患者組之間有顯著表達(dá)差異，見圖10。

圖8 正常組與CML患者組差異基因表達(dá)的火山圖譜分析

圖9 正常組與CML患者組差異基因表達(dá)的熱圖

圖10 正常組與CML患者組CXCL8表達(dá)差異

3.9 ELISA

根據(jù)核心靶點(diǎn)篩選結(jié)果，CXCL8的連接度值最高，因此采用ELISA驗(yàn)證PAE對K562細(xì)胞中CXCL8含量的影響，結(jié)果見圖11。與正常組比較，藥物干預(yù)組CXCL8（IL-8）蛋白表達(dá)量顯著下降，并呈濃度依賴趨勢。

圖11 PAE對IL-8蛋白表達(dá)量的影響

3.10 Western blot

采用Western blot驗(yàn)證PAE對K562細(xì)胞中CXCL8（IL-8）含量的影響，結(jié)果見圖12。與正常組比較，藥物干預(yù)組CXCL8蛋白表達(dá)量顯著下降且呈濃度依賴趨勢，與ELISA結(jié)果一致。

圖12 PAE對IL-8蛋白表達(dá)量的影響

4 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是以系統(tǒng)生物學(xué)和多向藥理學(xué)為基礎(chǔ)的研究方法。通過構(gòu)建藥物-靶點(diǎn)-疾病多層次相互作用網(wǎng)絡(luò)[19]，研究藥物和疾病的共同靶點(diǎn)及其生物活性和信號通路。本研究通過PPI網(wǎng)絡(luò)分析PAE抗CML潛在靶點(diǎn)共涉及CXCL8、NR3C1、ESR1、CRP、REN、TXN、AR、NFKB1、RHOA、NR3C2等14個(gè)核心靶點(diǎn)，對其進(jìn)行GO及KEGG生物通路富集分析主要涉及類固醇激素的反應(yīng)（response to steroid hormone）、激素介導(dǎo)的信號通路（hormone-mediated signaling pathway）及趨化因子信號通路（chemokine signaling pathway）等。此外，生信分析結(jié)果表明CXCL8在CML患者和健康人群之間有顯著差異表達(dá)。

CXCL8與其受體（CXCR1/2）結(jié)合，激活多種信號通路，通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化促血管生成、抑制抗腫瘤免疫和影響腫瘤微環(huán)境成分[20]促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。本文研究結(jié)果表明PAE能顯著降低CXCL8在慢性粒細(xì)胞白血病K562細(xì)胞中的表達(dá)，且作用呈濃度依賴性，表明PAE可通過調(diào)控CXCL8抑制K562細(xì)胞的生長，改善慢性粒細(xì)胞白血病的發(fā)生與發(fā)展。

綜上，本研究運(yùn)用分子對接和生物信息學(xué)分析初步驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出的最有潛力的靶點(diǎn)CXCL8，并通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證CXCL8可能是PAE治療CML過程中的重要靶點(diǎn)。這為PAE抗CML提供了新的思路，也為天然小分子抗腫瘤藥物的研究與開發(fā)提供理論依據(jù)。