韋開(kāi)聽(tīng)，羅朝亮，蔣 莉，龍立活，鄧秀芝，蘇煉礽，吳芳芳，陳 路

（廣西壯族自治區(qū)藥用植物園 西南瀕危藥材資源開(kāi)發(fā)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530023）

八珍袋泡茶原方出自明代醫(yī)家薛己所著的《正體類(lèi)要》，是由黨參、炒白術(shù)、茯苓、甘草、當(dāng)歸、白芍、川芎、熟地黃八味中藥材組成，都具有補(bǔ)氣益血之功效[1]，適用于氣血兩虛，面色萎黃，四肢乏力等癥狀。其中當(dāng)歸補(bǔ)血活血，調(diào)經(jīng)止痛，潤(rùn)腸通便；茯苓清利濕熱，利膽退黃；甘草瀉水逐飲，消腫散結(jié)；川芎活血行氣，祛風(fēng)止痛；白芍養(yǎng)血調(diào)經(jīng)，斂陰止汗，柔肝止痛，平抑肝陽(yáng)，諸藥合用具有補(bǔ)氣益血之功效[1]，適用于氣血兩虛，面色萎黃，四肢乏力等癥。茯苓、白芍、甘草中分別含茯苓多糖、芍藥苷、甘草酸成分，均具有免疫調(diào)節(jié)作用[2-4]。當(dāng)歸、川芎為臨床常用的養(yǎng)血活血藥[5]，其有效成分藁本內(nèi)酯對(duì)婦科疾病[6]、心血管系統(tǒng)[7]有較強(qiáng)藥理活性，在治療循環(huán)系統(tǒng)疾病過(guò)程中，能擴(kuò)張血管、增加冠脈流量[8]。

1991年出版的《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》收錄八珍袋泡茶的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，迄今逾三十多年仍在收錄范圍內(nèi)，但其完善與提高的空間很大，目前有關(guān)八珍袋泡茶中的同時(shí)測(cè)定不同成分的含量和薄層色譜（TLC）定性鑒別相對(duì)較少，八珍袋泡茶方中藥材多，單個(gè)藥材成分的鑒定和含測(cè)較為復(fù)雜，本研究在現(xiàn)在有文獻(xiàn)報(bào)道的基礎(chǔ)上，結(jié)合《中國(guó)藥典》2020版中當(dāng)歸、川芎、茯苓、甘草質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)方法，采用TLC同時(shí)對(duì)當(dāng)歸和川芎，茯苓和甘草進(jìn)行定性鑒，以高效液相法（HPLC）同時(shí)測(cè)定芍藥苷和藁本內(nèi)酯的含量，以期為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，對(duì)保證其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善和提高具有重要意義。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

VARIAN 210型高效液相色譜儀（美國(guó)瓦里安公司）；MS 205 DU型十萬(wàn)分之一電子天平（瑞士Mettle-Toledo有限公司）；BSA124S型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；SB-5200D型超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份公司，功率為200 W，頻率為40 kHz）；UV-1240型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本Shimadzu UV公司）；ZF-8型暗箱式四用紫外分析儀（上海嘉鵬科技有限公司）。

1.2 試藥

當(dāng)歸對(duì)照藥材（批號(hào)：120927-201617），川芎對(duì)照藥材（批號(hào)：120918-201813），茯苓對(duì)照藥材（批號(hào)：121117-201910），甘草對(duì)照藥材（批號(hào)：120904-202021），芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)：110736-202044，含量以96.8 %計(jì)）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；藁本內(nèi)酯對(duì)照品（上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)：Z812557，含量≥99 %）；乙腈、磷酸為色譜級(jí)試劑，水為超純水，其余試劑均為分析純?cè)噭?；八珍袋泡茶?批（廣西藥用植物園制藥廠(chǎng)生產(chǎn)，批號(hào)分別為：210101，210102，210401，規(guī)格：2.4 g/袋）。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC鑒別

2.1.1 當(dāng)歸、川芎的鑒別 取本品2袋，加入30 ml石油醚，超聲處理30 min，取出，濾過(guò)，濾液揮干，殘?jiān)? ml環(huán)己烷使溶解，作為供試品溶液；取當(dāng)歸、川芎對(duì)照藥材粉各1 g，分別同法制成對(duì)照藥材溶液；按八珍袋泡茶處方取缺當(dāng)歸、川芎的其余藥材按工藝制成缺當(dāng)歸、川芎陰性樣品，同法制成陰性對(duì)照溶液。按2020年版《中國(guó)藥典》（四部）通則0502 薄層色譜法[9]，吸取上述4種溶液各5 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板，以環(huán)己烷-乙酸乙酯（9:1）為展開(kāi)劑，飽和30 min，展開(kāi)，取出，晾干后置于365 nm紫外光下檢視。結(jié)果顯示，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上供試品色譜顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無(wú)干擾，見(jiàn)圖1A。

2.1.2 茯苓、甘草的鑒別 按2.1.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液；取茯苓、甘草對(duì)照藥材粉各1 g，加入30 ml石油醚，超聲處理30 min，取出，濾過(guò)，濾液揮干，殘?jiān)? ml環(huán)己烷使溶解，分別制成對(duì)照藥材溶液；按八珍袋泡茶處方取缺茯苓、甘草的其余藥材按工藝制成缺茯苓、甘草陰性樣品，同法制成陰性對(duì)照溶液。按2020年版《中國(guó)藥典》（四部）通則0502 薄層色譜法[9]，吸取上述4種溶液各10 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板，以環(huán)己烷-氯仿-丙酮（10:2:0.7）為展開(kāi)劑，飽和30 min，展開(kāi)，取出，晾干后噴10 %硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點(diǎn)清晰，放置10 min，紫外光（365 nm）下檢視。結(jié)果顯示，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上供試品色譜顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無(wú)干擾，見(jiàn)圖1B。

圖1 TLC色譜圖

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 Kromasil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1 %磷酸水溶液（B），梯度洗脫（程序見(jiàn)表1）。檢測(cè)波長(zhǎng)：0～15 min：230 nm（檢測(cè)芍藥苷），15～30 min：280 nm（檢測(cè)藁本內(nèi)酯）；流速：1.0 ml/min；柱溫：30 °C；進(jìn)樣量：10 μl；理論塔板數(shù)以芍藥苷峰、藁本內(nèi)酯峰計(jì)算，都不低于4000。

表1 梯度洗脫程序

2.2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱(chēng)取芍藥苷對(duì)照品、藁本內(nèi)酯對(duì)照品適量，加70 %乙醇制成芍藥苷濃度為0.1588 mg/ml、藁本內(nèi)酯濃度為0.1400 mg/ml的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，精密量取上液5 ml，置10 ml棕色量瓶中，即得混合對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液制備 精密稱(chēng)取八珍袋泡茶樣品1 g，置50 ml具塞瓶中，精密加入70 %乙醇25 ml，稱(chēng)重并浸泡1 h，超聲處理30 min，取出，放冷，再稱(chēng)定重量，用70 %乙醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性樣品溶液制備 按八珍袋泡茶處方比例，取缺白芍、當(dāng)歸、川芎的其余藥材，按工藝制成缺白芍、當(dāng)歸、川芎陰性樣品，并按2.2.3項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液，即得。

2.2.5 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 分別精密吸取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液各10 μl，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，見(jiàn)圖2。結(jié)果顯示，供試品中芍藥苷、藁本內(nèi)酯與混合對(duì)照品在相同的保留時(shí)間處有相應(yīng)的色譜峰，峰形良好，與其他色譜峰分離度大于1.5，且陰性對(duì)照無(wú)干擾，表明方法具有良好的專(zhuān)屬性。

圖2 高效液相色譜圖（0～15 min：230 nm；15～30 min：280 nm）

2.2.6 線(xiàn)性關(guān)系考察 分別精密量取2.2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液儲(chǔ)備液1，2，3，4，5，6，7，8 ml，分別置于10 ml量瓶中，加入70 %乙醇定容到刻度，搖勻。按2.2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算回歸方程，得芍藥苷、藁本內(nèi)酯回歸方程分別為：Y=33.7046X+35.8124，r=0.9998；Y=6.5671X+4.8128，r=0.9996。結(jié)果表明，芍藥苷、藁本內(nèi)酯濃度分別在15.9～127.1 μg/ml、14.0～112.0 μg/ml范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.2.7 精密度試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液適量，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積并計(jì)算RSD值，考察芍藥苷、藁本內(nèi)酯混合對(duì)照品峰面積的變化情況。結(jié)果表明，芍藥苷、藁本內(nèi)酯峰面積RSD分別為0.71 %，0.82 %，表明該儀器精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取八珍袋泡茶（批號(hào)：210101）樣品1 g，按2.2.3項(xiàng)下方法制備樣品溶液，再按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，分別在0，1，2，4，8，12，24 h進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算RSD值，考察八珍袋泡茶供試品溶液室溫下放置不同時(shí)間峰面積變化情況。結(jié)果表明，供試品溶液中芍藥苷、藁本內(nèi)酯峰面積RSD分別為1.18 %，1.55 %，表明該供試品溶液在24 h內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定。

2.2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取八珍袋泡茶（批號(hào)：210101）樣品1 g，共6份，按2.2.3項(xiàng)下方法制備樣品溶液，再按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄6份芍藥苷、藁本內(nèi)酯的峰面積以計(jì)算含量。結(jié)果表明，芍藥苷、藁本內(nèi)酯平均含量分別為1.9076，1.1873 mg/g，RSD分別為0.94 %，1.09 %。說(shuō)明方法重復(fù)性良好。

2.2.10 加樣回收試驗(yàn) 精密稱(chēng)取芍藥苷對(duì)照品0.0130 g、藁本內(nèi)酯對(duì)照品0.0078 g，置25 ml量瓶中，加70 %乙醇溶解并稀釋至刻度，配成含芍藥苷0.5034 mg/ml、藁本內(nèi)酯0.3120 mg/ml的混合對(duì)照品溶液；精密稱(chēng)取八珍袋泡茶（芍藥苷含量為1.9076 mg/g，藁本內(nèi)酯含量為1.1873 mg/g）樣品0.5 g，共9份，依次精密加入混合對(duì)照品溶液（芍藥苷濃度 0.5034 mg/ml，藁本內(nèi)酯濃度0.3120 mg/ml）1，2，3 ml，各3份，按2.2.3項(xiàng)下方法制備樣品溶液，再按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果芍藥苷、藁本內(nèi)酯平均回收率分別為98.64 %，98.34 %，其RSD分別為1.36 %，1.64 %，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 加樣回收試驗(yàn)（n=9）

2.2.11 樣品含量測(cè)定 精密稱(chēng)取八珍袋泡茶3批不同批號(hào)的樣品，每批各1 g，按2.2.3項(xiàng)下方法制備樣品溶液，再按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄芍藥苷、藁本內(nèi)酯峰面積并計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n=3）

3 討論

八珍袋泡茶方中藥材種類(lèi)較多，為了更有效地控制其質(zhì)量，本研究對(duì)處方中的藥材開(kāi)展薄層鑒別，采用HPLC對(duì)有效成分進(jìn)行定量測(cè)定。根據(jù)《中國(guó)藥典》2020年版一部藥材項(xiàng)下的相關(guān)方法并結(jié)合近年發(fā)表的研究成果[10-12]，采用薄層色譜法分別同時(shí)對(duì)當(dāng)歸和川芎進(jìn)行鑒別，對(duì)茯苓和甘草進(jìn)行鑒別，相較于現(xiàn)有的單個(gè)藥材鑒別方法，該方法更加高效且可行。藁本內(nèi)酯是當(dāng)歸、川芎的主要活性成分之一[13-14]，在以HPLC測(cè)定芍藥苷含量的基礎(chǔ)上，通過(guò)不斷考察不同流動(dòng)相梯度洗脫方法[15-17]，最終以乙腈-0.1 %磷酸為梯度洗脫流動(dòng)相，建立了同時(shí)測(cè)定藁本內(nèi)酯和芍藥苷含量的測(cè)定方法。

八珍袋泡茶療效明顯，臨床應(yīng)用廣泛，但其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不夠完善，現(xiàn)有的標(biāo)準(zhǔn)僅對(duì)單個(gè)藥材進(jìn)行定性和定量分析，不能很好地控制產(chǎn)品質(zhì)量。本研究提升了八珍袋泡茶的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)現(xiàn)有較為復(fù)雜的研究方法進(jìn)行了優(yōu)化，節(jié)約了檢測(cè)成本。此外，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的提升，進(jìn)一步保證了用藥安全。研究結(jié)果表明，建立的檢測(cè)方法簡(jiǎn)便可行，對(duì)批量生產(chǎn)的成品檢測(cè)具有指導(dǎo)意義。