劉曼婷，楊玉暢，胡盼祥，董曉旭，尹興斌，曲昌海，倪 健

（北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 102488）

金銀花（Lonicerae Japonicae Flos）味甘，性寒，具有清熱解毒，疏散風(fēng)熱的功效，臨床用于治療喉痹，風(fēng)熱感冒。黃連（Coptidis Rhizoma）味苦，性寒，具有清熱燥濕，瀉火解毒的功效，臨床用于治療癰腫疔瘡，牙痛口瘡[1]。二者均為清熱藥，臨床常配伍使用。數(shù)據(jù)挖掘156首含黃連的處方中，配伍金銀花使用25首，如清營湯、銀花解毒湯、梔子金花丸等[2]。金銀花-黃連配伍的經(jīng)典方劑最早來源于《外科發(fā)揮》的清咽利膈湯，主治急性咽喉痛，肺胃實(shí)熱，咽喉紅腫疼痛，痰涎壅盛。通過《中醫(yī)方劑大辭典》數(shù)據(jù)挖掘，已知金銀花、黃連均是喉痹內(nèi)服方劑中使用頻數(shù)＞20的中藥[3]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，二者可抑制痢疾桿菌，提高機(jī)體體液免疫和細(xì)胞免疫及網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬功能，可合用治療喉嚨腫痛[4-6]。咽炎（pharyngitis）是咽部黏膜、黏膜下組織及其淋巴組織由病毒、細(xì)菌、真菌（如肺炎支原體、A組鏈球菌）等感染引起的非特異性炎癥，常為肺炎等疾病的前驅(qū)癥狀[7-8]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是依托系統(tǒng)生物學(xué)，從三維整體觀探究中藥多成分、多靶點(diǎn)、多通路協(xié)作機(jī)制，構(gòu)建分析“成分-基因-疾病”的多維度生物機(jī)制網(wǎng)絡(luò)，從而降低藥物的研發(fā)成本，指導(dǎo)臨床精準(zhǔn)用藥[9-11]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法構(gòu)建金銀花-黃連的可視化網(wǎng)絡(luò)，解析金銀花-黃連治療咽炎的活性成分、作用靶標(biāo)、生物學(xué)機(jī)制，并進(jìn)行初步動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，以期闡明其治療咽炎的效應(yīng)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫

數(shù)據(jù)庫信息見表1。

表1 數(shù)據(jù)庫信息

1.2 化學(xué)成分的篩選與核對

登錄TCMSP搜索金銀花、黃連的有效成分，設(shè)置DL≥0.18，OB≥30 %，對有效成分進(jìn)行篩選，將所得成分的結(jié)構(gòu)輸入Pubchem核對結(jié)構(gòu)、名稱、分子式，最終獲得關(guān)鍵化合物。

1.3 潛在靶點(diǎn)的預(yù)測與篩選

將關(guān)鍵化合物的信息輸入Pharm Mapper數(shù)據(jù)庫，獲得候選基因的靶點(diǎn)信息，并通過Uniprot數(shù)據(jù)庫進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，再與通過Genecards數(shù)據(jù)庫篩選出咽炎的靶點(diǎn)基因進(jìn)行映射，得到藥物-疾病候選基因的VENN圖。

1.4 構(gòu)建多水平網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)

1.4.1 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將金銀花-黃連與咽炎的潛在靶點(diǎn)基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫，設(shè)置物種為人類（Homosapiens），獲得蛋白互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，設(shè)置蛋白關(guān)系評分為0.4，隱藏游離蛋白，篩選排名前15的核心基因。

1.4.2 “藥物-化合物-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 使用Cytoscape 3.7.1軟件對所得信息進(jìn)行三維網(wǎng)絡(luò)處理，使“藥物-化合物-靶點(diǎn)-疾病”的關(guān)系以網(wǎng)絡(luò)圖的形式呈現(xiàn)。在這個(gè)網(wǎng)絡(luò)圖中，將關(guān)鍵化合物和靶點(diǎn)設(shè)置為節(jié)點(diǎn)，邊代表節(jié)點(diǎn)之間相互作用的關(guān)系。

1.5 靶點(diǎn)通路富集分析

將潛在靶點(diǎn)基因輸入DAVID數(shù)據(jù)庫，并指定物種為“Homosapiens”，界定閾值P＜0.05，將分析結(jié)果繪制成氣泡圖，圖中基因數(shù)用氣泡大小表示，P值高低用氣泡顏色表示。

1.6 分子對接前處理

在RCSB 蛋白數(shù)據(jù)庫中輸入蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖中度值前三的靶蛋白名稱，選取最高分辨率的靶蛋白結(jié)構(gòu)，使用Pymol軟件預(yù)處理：（1）去除水分子；（2）去除原配體分子；（3）運(yùn)行AutoDockTolls 4.2.6為受體分子加極性氫；利用 Chem3D將關(guān)鍵成分文件轉(zhuǎn)化為mol2格式。

1.7 分子對接

將前處理后的配體和關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入AutoDock 4.2.6進(jìn)行格點(diǎn)能計(jì)算，進(jìn)行分子對接。以最低結(jié)合能作為靶蛋白和配體對接的結(jié)果，使用Pymol軟件進(jìn)行可視化處理。

1.8 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.8.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠36只，雄性，SPF級，體重200±20 g，購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2022-0010。

1.8.2 主要藥品與試劑 黃連飲片（批號：501002642，北京同仁堂藥材有限責(zé)任公司）；金銀花（批號：20180427，北京本草方源藥業(yè)集團(tuán)有限公司）；大鼠基質(zhì)金屬蛋白酶2 ELISA試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）；大鼠白介素2（IL-2）ELISA檢測試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）；阿司匹林（上海上藥信誼藥廠有限公司）。

1.8.3 藥物制備 參考文獻(xiàn)[12]，以水提醇沉的方法制備黃連-金銀花浸膏粉，黃連與金銀花的質(zhì)量比為1:2，加水煎煮3次，每次加8倍量水煎煮1 h，合并藥液，加入乙醇使含醇量達(dá)50 %，置于4 ℃冰箱過夜，過濾雜質(zhì)，減壓旋蒸、真空干燥得到干浸膏粉，每克含生藥材3.1 g，置陰涼干燥處密封保存。

1.8.4 造模與給藥 取36只正常SD大鼠隨機(jī)分為6組，分別為空白對照組，模型組，高、中、低劑量金銀花-黃連組，阿司匹林陽性對照組，每組6只。正常組大鼠咽部噴生理鹽水，其余組大鼠造急性咽炎模型，用喉頭噴霧器向其咽部噴霧25 %氨水，2次/d，上午、下午各1次，每次噴3下，連續(xù)噴3 d，大鼠造模成功的標(biāo)志為咽部黏膜出血、紅腫[13]。于第4天起，對大鼠進(jìn)行灌胃給藥，每天1次，連續(xù)給藥7 d，高、中、低劑量給藥組分別給予金銀花-黃連浸膏粉2.8，1.4，0.7 g/(kg·d)，陽性對照組給予阿司匹林200 mg/kg，空白對照組和模型組給予生理鹽水10 ml/kg。

1.8.5 觀測指標(biāo) 實(shí)驗(yàn)過程中每天觀察并記錄各組動(dòng)物飲食情況、活動(dòng)情況、咽部黏膜狀態(tài)（包括顏色、分泌物等）。大鼠灌胃1周后腹主動(dòng)脈取血，血液室溫自然凝固10～20 min后，3000 r/min、4 ℃離心15 min，取上清，按試劑盒說明書操作，采用ELISA法測定各組大鼠血清中基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）、IL2的含量。

1.8.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)一采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間數(shù)據(jù)采用單因素方差分析；各組間的兩兩比較，方差齊采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊采用Tamhane’s檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 金銀花-黃連關(guān)鍵化合物的篩選

本研究初步篩選出關(guān)鍵化合物37個(gè)，其中包括黃連的關(guān)鍵化合物14個(gè)，金銀花的關(guān)鍵化合物23個(gè)。經(jīng)與Pubchem核對后共得33個(gè)關(guān)鍵化合物，表2為關(guān)鍵化合物信息采集表。

表2 金銀花-黃連中的關(guān)鍵化合物

2.2 潛在治療靶點(diǎn)基因的預(yù)測

在TCMSP平臺下載關(guān)鍵化合物的信息以“mol2”的格式導(dǎo)入Pharm Mapper數(shù)據(jù)庫，獲得802個(gè)靶標(biāo)信息，經(jīng)刪除重復(fù)項(xiàng)剩余183個(gè)，并以此構(gòu)建關(guān)鍵化合物靶標(biāo)信息數(shù)據(jù)庫，通過Uniprot進(jìn)行基因ID的標(biāo)準(zhǔn)化核對，并使用R語言校準(zhǔn)。通過Genecards數(shù)據(jù)庫檢索咽炎的靶點(diǎn)基因，輸入“pharyngitis”，獲取基因共1803個(gè)，將金銀花-黃連與咽炎的靶點(diǎn)基因進(jìn)行映射，得到金銀花-黃連-咽炎的潛在治療靶點(diǎn)基因共46個(gè)（見表3），并通過R語言繪制成VENN圖（見圖1）。

表3 金銀花-黃連治療咽炎的潛在靶點(diǎn)基因

圖1 金銀花-黃連靶標(biāo)與咽炎靶標(biāo)的韋恩圖

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

PPI網(wǎng)絡(luò)圖見圖2。該網(wǎng)絡(luò)包含207條邊，46個(gè)節(jié)點(diǎn)，靶蛋白平均度值為9，有22個(gè)靶蛋白的度值超過9（見圖3），說明這22個(gè)靶蛋白是PPI網(wǎng)絡(luò)中的重要靶點(diǎn)。

圖2 金銀花-黃連潛在治療靶點(diǎn)的相互作用網(wǎng)絡(luò)

圖3 金銀花-黃連治療咽炎的重要靶點(diǎn)

2.4 繪制作用機(jī)制可視化網(wǎng)絡(luò)

將篩選獲得的藥物活性成分、潛在治療靶點(diǎn)基因、藥物、疾病名稱導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件，設(shè)置節(jié)點(diǎn)與邊線，將其相互關(guān)系繪制成可視化“藥物-化合物-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖（見圖4）。網(wǎng)絡(luò)共涉及節(jié)點(diǎn)（Nodes）77個(gè)，邊線（Edges）378條，其中長方形節(jié)點(diǎn)代表潛在治療靶點(diǎn)基因，菱形節(jié)點(diǎn)代表藥物活性成分，圓形節(jié)點(diǎn)代表藥物，三角形節(jié)點(diǎn)代表疾病，邊線表示化合物、靶點(diǎn)、藥物、疾病之間存在相關(guān)性。通過插件cytoNCA按度（degree）、緊密度（closeness）兩種屬性分別取平均值排序，篩選兩者均大于平均值（分別為9.82和106.03）且靠前的成分或者靶點(diǎn)。成分有obacunone（黃柏酮）、palmidin A（掌葉二蒽酮A）、caeruloside C、quercetin（槲皮素），靶點(diǎn)有HRAS。

圖4 中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 Go與KEGG通路分析

共獲得GO條目48個(gè)（P＜0.05），涉及生物過程（BP）條目34個(gè)，細(xì)胞組成（CC）條目6個(gè)，分子功能（MF）條目8個(gè)，分別占72 %，11 %，17 %，根據(jù)P值由小到大篩選排名前20的通路繪制氣泡圖（見圖5～7），未滿足20條通路的功能選取其所有通路。含靶點(diǎn)數(shù)量越多的通路對咽炎的治療潛力越大，生物過程分析中（見圖5）靶點(diǎn)富集數(shù)目較多的有蛋白水解（proteolysis）、細(xì)胞增殖調(diào)控（regulation of cell proliferation）、凋亡過程負(fù)調(diào)控（negative regulation of apoptotic process）；分子功能分析（見圖6）中靶點(diǎn)富集數(shù)目較多的有鋅離子結(jié)合（zinc ion binding）、ATP結(jié)合（ATP binding）、受體結(jié)合（receptor binding）；細(xì)胞組分分析（見圖7）中靶點(diǎn)富集數(shù)目較多的有細(xì)胞外基質(zhì)（extra cellular matrix）、內(nèi)吞小泡（endocyticvesicle）、膜筏（membraneraft）。

圖5 金銀花-黃連潛在靶標(biāo)的生物功能富集分析

圖6 金銀花-黃連潛在靶標(biāo)的分子功能富集分析

圖7 金銀花-黃連潛在靶標(biāo)的細(xì)胞組分富集分析

KEGG通路富集篩選得到48條信號通路（P＜0.05），根據(jù)P值由小到大篩選排名前20的通路繪制氣泡圖（見圖8），經(jīng)分析得雌激素信號通路（estrogen signaling pathway）、促性腺激素釋放激素信號通路（GnRH signaling pathway）、Ras信號通路（Ras signaling pathway）、T細(xì)胞受體信號通路（T cell receptor signaling pathway），這4條信號通路是治療咽炎的主要通路。

圖8 金銀花-黃連潛在靶標(biāo)的KEGG通路富集分析

2.6 分子對接結(jié)果

結(jié)果見表 4，表示活性化合物和靶蛋白具有結(jié)合能力。結(jié)果表明，靶蛋白與活性成分之間結(jié)合活性度越高，最低結(jié)合能的絕對值就會越低，說明兩者之間結(jié)合能力越好。圖9表示靶蛋白與活性化合物對接最好的組合，結(jié)果顯示，黃柏酮、掌葉二蒽酮A等與抗咽炎藥物潛在作用靶點(diǎn)具有自發(fā)的親和力。

圖9 Obacunone與MMP-2、Palmidin A與MAPK1、Obacunone與EGFR的結(jié)合模式

表4 關(guān)鍵靶點(diǎn)與關(guān)鍵化合物的對接結(jié)果

2.7 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果

2.7.1 各組大鼠一般情況與癥狀表現(xiàn) 造模3 d后，正常組大鼠正常飲食，活動(dòng)正常，咽部黏膜形態(tài)正常，未見分泌物；模型組大鼠食欲下降，精神欠佳，咽部黏膜出現(xiàn)充血、腫脹，黏液分泌增多，同時(shí)伴有搔抓口部的現(xiàn)象。灌胃1周后，金銀花-黃連各劑量給藥組、阿司匹林組大鼠咽部黏膜的紅腫狀態(tài)均有不同程度減輕。

2.7.2 各組大鼠血清中MMP-2和IL-2水平 上述網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果表明黃連-金銀花可能作用于MMP-2、IL-2等靶點(diǎn)發(fā)揮抗咽炎的作用，本研究進(jìn)一步驗(yàn)證了金銀花-黃連對急性咽炎大鼠血清中MMP-2、IL-2水平的影響，見表5。由表5可見，模型組大鼠血清中的MMP-2和IL-2水平較正常組升高（P＜0.05），另外阿司匹林組及JYH-HL各劑量給藥組大鼠血清中的MMP-2和IL-2含量較模型組降低（P＜0.05），提示金銀花-黃連能降低急性咽炎大鼠血清中IL-2和MMP-2的表達(dá)。

表5 各組大鼠血清中MMP-2和IL-2含量（ ±s，n=6）

表5 各組大鼠血清中MMP-2和IL-2含量（ ±s，n=6）

注：與空白對照組比較：#P＜0.05；與模型組比較：*P＜0.05

組別 MMP-2/pg·ml-1 IL-2/pg·ml-1空白對照組 536.32±41.34 24.71±3.45模型組 720.78±39.67# 36.88±3.97#金銀花-黃連高劑量組 613.63±53.78* 28.69±2.56*金銀花-黃連中劑量組 654.78±58.43* 31.02±2.88*金銀花-黃連低劑量組 686.98±40.12* 32.74±1.37*阿司匹林組 624.12±47.86* 27.04±2.41*

3 討論與結(jié)論

本研究通過可視化網(wǎng)絡(luò)分析篩選出金銀花-黃連治療咽炎的4個(gè)潛在活性成分，分別為黃柏酮（obacunone）、掌葉二蒽酮A（palmidin A）、caeruloside C、槲皮素（quercetin）。通過PPI篩選發(fā)現(xiàn)MAPK1、EGFR、MMP-2、IL-2、HRAS、CASP3、ALB等是金銀花-黃連治療咽炎的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

綜上，金銀花-黃連治療咽炎的作用機(jī)制可能是其有效成分黃柏酮、掌葉二蒽酮A、Caeruloside C、槲皮素通過MAPK1、EGFR、MMP-2、IL2、HRAS、CASP3、ALB等關(guān)鍵蛋白介導(dǎo)雌激素信號通路、GnRH信號通路、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、T細(xì)胞受體信號通路、MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路等協(xié)作產(chǎn)生抗炎、免疫殺傷、黏膜修復(fù)、運(yùn)化外毒素等直接作用以及黏附緩釋等間接作用來防治咽炎。