孟祥兆，于洪遠(yuǎn)，孟淑萍

1.北京航天總醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100076；2.北京海淀醫(yī)院兒科，北京 100080

在臨床分離到的致病性革蘭陽性球菌中最常見的一種就是金黃色葡萄球菌（SA），可引起多種嚴(yán)重的臨床感染，如血流感染引起敗血癥、皮膚軟組織感染引起癤、呼吸系統(tǒng)感染引起肺炎等。金葡菌引起感染性疾病的主要原因是能分泌多種外毒素，主要包括：腸毒素（SEs）、殺白細(xì)胞毒素（PVL）、中毒休克綜合征毒素-1 （TSST-1）、表皮剝脫性毒素（ETs）等，可導(dǎo)致患者產(chǎn)生化膿性感染、食物中毒等臨床癥狀，嚴(yán)重的可以引起中毒性休克綜合征等致死性疾?。?］。目前，臨床針對葡萄球菌蛋白A（SPA）基因的多態(tài)性進(jìn)行測序，進(jìn)而對葡萄球菌進(jìn)行SPA基因分型分析，以獲得其流行病學(xué)信息。在控制由SA 感染引起的短期爆發(fā)流行或醫(yī)院內(nèi)傳播時(shí)，可以提供基礎(chǔ)理論依據(jù)，為控制SA 的感染與傳播提供有力支持［2］。本研究使用PCR擴(kuò)增及測序等分子生物學(xué)方法對該研究時(shí)間段內(nèi)從北京航天總醫(yī)院臨床分離到的SA 菌株進(jìn)行流行病學(xué)信息調(diào)查，旨在獲取本院SA 的優(yōu)勢流行菌株的分子生物學(xué)信息和毒力基因攜帶情況，進(jìn)而為控制SA 的感染和傳播提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018 年10 月—2019 年3 月北京航天總醫(yī)院檢驗(yàn)科微生物室分離得到的臨床來源非重復(fù)金黃色葡萄球菌50株，其中來源于痰液35株、血液6株、膿液3株。其他來源6株（包括尿液、胸水、腹水等）。所有菌株均-80 ℃留存待用。

1.2 儀器與試劑

VITEK 2 Compact 全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析儀（法國梅里埃公司）；96 孔PCR 儀（上海宏石公司）；TOCAN凝膠成像系統(tǒng)（上海天呈公司）；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（A1120，普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司）；PCR 純化回收試劑盒（DP214，北京天根生物技術(shù)有限公司）；PCR 擴(kuò)增上下游引物以及PCR 酶和預(yù)混液（賽默飛公司）。

1.3 方法

1.3.1 復(fù)活已經(jīng)收集到的50 株實(shí)驗(yàn)菌株 使用梅里埃VITEK 2 Compact 全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)進(jìn)行菌株鑒定及藥敏試驗(yàn)。

1.3.2 金黃色葡萄球菌DNA 提取 提取所有復(fù)活的SA 實(shí)驗(yàn)菌株的DNA，均使用普洛麥格細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒（A1120），操作過程均按照試劑盒說明書進(jìn)行。得到的DNA作為PCR擴(kuò)增的模板。

1.3.3 mecA 基因、PVL 基因以及毒素基因的檢測 經(jīng)過前期實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證后本研究使用擴(kuò)增程序檢測mecA 基因和PVL 基因，其中mecA 基因擴(kuò)增引物序列為mecA-F：5-AAAATCGATGGTAAAGGTTGGC-3，mecA-R ：5-AGT TCTGCAGTACCGGATTTGC-3，PVL 基因擴(kuò)增引物序列為PVl-F:5-ATCATTAGGTAAA ATGTCTGGACATGATCCA-3;PVl-R:5-GCATCAASTGTATTGGATAGCAAAAGC-3。另檢測了SEA、SEB、SEC、ETA、TST 及sasX 共6 種毒素基因，檢測方法及擴(kuò)增引物序列均參照文獻(xiàn)［3］。獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，通過凝膠成像系統(tǒng)觀察到出現(xiàn)目的條帶的為相應(yīng)基因陽性，無目的條帶的為相應(yīng)基因陰性。經(jīng)過藥敏鑒定頭孢西丁耐藥或PCR 擴(kuò)增mecA 基因陽性的SA定義為MRSA。

1.3.4 SPA 分型 根據(jù)序列及實(shí)驗(yàn)要求設(shè)計(jì)SPA 分型PCR擴(kuò)增引物和反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序。對擴(kuò)增所得到的陽性產(chǎn)物進(jìn)行純化和回收后，送生工生物有限公司進(jìn)行測序。使用Bionumerics 6.6 軟件對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，根據(jù)串聯(lián)重復(fù)序列的排列方式確定菌株的SPA型別。

2 結(jié)果

2.1 MRSA檢測

根據(jù)苯唑西林藥敏結(jié)果發(fā)現(xiàn)，50 株SA 中包括28 株MRSA（56%）和22株MSSA（44%）。28株MRSA中mecA基因均為陽性，22株MSSA中mecA基因均為陰性。

2.2 毒力基因檢測結(jié)果

50 株菌中，攜帶率最高的毒素基因是SEA 為84.0%，而TST、sasX 均未檢測到陽性菌株，在兩株MSSA 中檢測到ETA陽性，4株MSSA中檢測到SEB陽性，1株MSSA中檢測到SEC 陽性，并且在MRSA 和MSSA 中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。PVL基因陽性的有2株（4.0%），兩例菌株均來源于穿刺液標(biāo)本，SPA 分型為MSSA-t701 和MSSA-t037，通過藥敏實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該兩例菌株僅對青霉素耐藥。毒素基因陽性的菌株，有12株可同時(shí)攜帶兩種毒素基因，共組成4種毒素基因型，包括：SEA+ETA 2 株，SEA+SEB 4 株，SEA+PVL 1株，SEA+ SEC 1株。具體結(jié)果見表1、表2。

表1 實(shí)驗(yàn)菌株基因篩查結(jié)果 例（%）

表2 SPA分型和毒素基因篩查結(jié)果

2.3 SPA分型結(jié)果

28株MRSA中，23株為t030（82.1%），主要來源是痰液（20株），2株為t019（7.1%），2株為t1081（7.1%），1株為t748（3.5%）。從22 株MSSA 中，共檢測到12 種SPA型別，以t1451、t091、t078 位列前3 位，分別占22.7%、18.2%、13.6%，除1 株MSSA 為t030 外，未發(fā)現(xiàn)其他與MRSA 具有相同SPA 分型的MSSA 菌株，另有1 株無法分型，見表3。

表3 實(shí)驗(yàn)菌株SPA型別重復(fù)序列

3 討論

臨床分離到的SA 尤其是MRSA 具有多部位感染和多藥耐藥的特性，使其成為最重要的院內(nèi)感染病原菌之一。因此，MRSA 與HBV 及AIDS 并列為世界三大難解決的感染性疾病。多項(xiàng)研究表明攜帶mecA 基因是MRSA 耐β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的主要原因之一，因此眾多研究將mecA基因的存在作為研究MRSA的重要分子標(biāo)記。臨床上分離到的金黃色葡萄球菌株在分子生物學(xué)特征上具有多態(tài)性，目前常用的區(qū)分其基因多態(tài)性的方法主要有多位點(diǎn)序列分析、SPA、基因分型以及葡萄球菌盒式染色體分型等。根據(jù)不同的分型方法可以將臨床分離到的菌株區(qū)分為不同的克隆株，有些克隆株為優(yōu)勢流行克隆，有些為偶發(fā)株，不同克隆株對抗菌藥物表現(xiàn)出不同的耐藥性，攜帶的毒力基因也不同［4］。因此明確特定區(qū)域特定疾病的SA 的克隆分型及其分子特征對控制及治療SA感染有重要意義。

SPA是SA細(xì)胞壁的重要組成成分之一，該蛋白由一段分子長度約為2 150 bp的基因序列進(jìn)行編碼產(chǎn)生，該段序列主要由Fc結(jié)合區(qū)、X區(qū)和C末端組成。其中X區(qū)含有2～15個(gè)數(shù)量不等，長約21～27 bp的重復(fù)序列，由于重復(fù)序列數(shù)目、特征和排列順序不同導(dǎo)致X 區(qū)具有高度的多態(tài)性，針對這段基因的多態(tài)性所建立的分型方法為SPA分型，該方法具有快速、易操作、重復(fù)性好的特點(diǎn)，并且操作成本較為低廉，適用于SA 感染的分子流行病學(xué)調(diào)查。本研究選擇使用該分型方法作為區(qū)分菌株多態(tài)性的手段。MRSA的SPA流行型別在我國有很大的地域分布差異，本研究發(fā)現(xiàn)，醫(yī)院該階段臨床分離到的MRSA 的主要型別是t030，與文獻(xiàn)報(bào)道的t030 為我國主要的流行克隆型之一結(jié)果一致，t030 不僅在我國廣泛分布，也是挪威、德國、荷蘭、瑞士、瑞典等國家的主要流行克隆型［5］。與MRSA呈現(xiàn)高度的克隆一致性不同，MSSA的分型較為分散，共檢出12個(gè)克隆型，并沒有優(yōu)勢克隆型的出現(xiàn)，除1 株MSSA 為t030 外，未發(fā)現(xiàn)其他與MRSA 具有相同SPA 分型的MSSA菌株。SA致病性強(qiáng)，能夠引起患者多種臨床癥狀與SA能夠產(chǎn)生多種外毒素有密切關(guān)系。SA 是否攜帶毒素基因，與感染后引起的臨床癥狀的嚴(yán)重程度成正相關(guān)。因此，在對SA 進(jìn)行研究時(shí)有必要對金葡菌攜帶的毒素基因進(jìn)行篩查。目前主要篩查的是SA 是否能產(chǎn)生腸毒素、殺白細(xì)胞毒素、中毒休克綜合征毒素-1、表皮剝脫性毒素。本研究選擇篩查了3種金葡菌腸毒素基因：SEA、SEB、SEC，剝脫毒素基因ETA，中毒休克綜合征毒素基因tst-1，以及sasX毒素基因和PVL毒素基因。本研究檢測的3種腸毒素基因，SEa攜帶率最高為84.0%，且在MRSA和MSSA中無明顯區(qū)別。攜帶SEB 基因的有四株，均為MSSA，均僅對紅霉素E、克林霉素CL、慶大霉素CN、青霉素P耐藥。這說明本院流行的SA 以攜帶的腸毒素基因以SEA 為主。sasX 基因可以編碼一種新的細(xì)胞壁錨定蛋白，從而增加SA的粘附和聚集能力，使得SA更易引起感染癥狀［6］。本研究未檢出醫(yī)院分離到的SA 攜帶sasX 基因，可能與本地區(qū)流行的菌株攜帶該毒素基因較少有關(guān)。

PVL 屬于膜穿孔毒素，可以增強(qiáng)SA 對宿主的抵抗力，與醫(yī)院獲得性SA相比，社區(qū)獲得性SA具有相對較高的PVL毒素基因攜帶率。本研究只篩查到兩株P(guān)VL陽性的MSSA，其中一菌株同時(shí)還攜帶有毒素基因SEA，且只對青霉素耐藥。檢出率遠(yuǎn)低于文獻(xiàn)報(bào)道的30%［7］，分析原因可能是和本實(shí)驗(yàn)收集到的菌株多為醫(yī)院獲得性SA，并且PVL 毒素基因目前在本地區(qū)的SA 中攜帶較少。明確流行環(huán)節(jié)、切斷傳播途徑、終止耐藥菌株在醫(yī)院和社區(qū)中的傳播是感染控制的重要策略之一，而掌握SA 的分子特征對于有效控制感染和鑒別菌株之間是否存在相關(guān)性至關(guān)重要。本研究雖然僅部分代表了醫(yī)院該階段內(nèi)SA 的分子流行病學(xué)情況，但是為SA 的臨床治療、感染控制和爆發(fā)流行監(jiān)測提供了有力依據(jù)。