潘凱茜, 陳聰, 張君, 李青, 呂萍

1.南方醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院,廣東 廣州 510515;2.南方醫(yī)科大學(xué)皮膚病醫(yī)院,廣東 廣州 510091

梅毒是一種由梅毒螺旋體引起的慢性性傳播疾病,在我國總發(fā)病率逐年增長[1-2]。梅毒螺旋體侵犯機(jī)體部位廣泛,可對不適用青霉素以及疏于治療的人群造成神經(jīng)、心血管、眼、骨骼、皮膚粘膜等多個(gè)器官的嚴(yán)重危害。固有免疫、體液免疫和細(xì)胞免疫均參與機(jī)體對梅毒的應(yīng)答過程[3-5],但確切的免疫學(xué)機(jī)制尚未完全闡明。近年來,一種命名為濾泡輔助性T細(xì)胞(follicular helper T cell,Tfh)的新型CD4+T細(xì)胞亞群被陸續(xù)報(bào)道。Tfh細(xì)胞存在于淋巴組織的生發(fā)中心及外周血中,具有促進(jìn)生發(fā)中心形成、B細(xì)胞成熟與分化、高親和力抗體產(chǎn)生等功能,參與多種自身免疫性疾病、傳染性疾病的免疫應(yīng)答過程[6-10]。目前,Tfh細(xì)胞與梅毒發(fā)病機(jī)制的關(guān)系尚未完全闡明,因此,本研究分析梅毒患者外周血Tfh細(xì)胞比例及其與病程、血清TRUST滴度的關(guān)系,探討Tfh細(xì)胞在梅毒發(fā)生發(fā)展過程中的作用。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2015年5月—2016年3月在南方醫(yī)科大學(xué)皮膚病醫(yī)院就診的84例梅毒患者,依據(jù)臨床診斷和病程將研究對象分為4組：治療前組、治療中組、治愈組、血清固定組。治療前組納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合WS273—2007《梅毒診斷標(biāo)準(zhǔn)》[11];②未經(jīng)任何梅毒治療。治療中組納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合WS273—2007《梅毒診斷標(biāo)準(zhǔn)》;②經(jīng)過規(guī)范抗梅毒治療1～6個(gè)月;③未達(dá)到臨床治愈。治愈組納入標(biāo)準(zhǔn)：①規(guī)范抗梅毒治療2年及以上;②梅毒臨床癥狀消失;③非梅毒螺旋體血清學(xué)試驗(yàn)陰性。血清固定組納入標(biāo)準(zhǔn)參考2015年《梅毒血清固定臨床處理專家共識》[12]：①經(jīng)過規(guī)范抗梅毒治療;②經(jīng)過隨訪(一期梅毒隨訪1年,2期梅毒隨訪2年,晚期梅毒隨訪3年);③非梅毒螺旋體血清學(xué)試驗(yàn)維持在一定滴度超過3個(gè)月;④排除再感染、神經(jīng)梅毒、心血管梅毒和生物學(xué)假陽性。納入同期醫(yī)院體檢健康者37例作為對照組,納入標(biāo)準(zhǔn)：①無不潔性交史;②無梅毒癥狀和體征;③非梅毒螺旋體血清學(xué)試驗(yàn)陰性。所有組別排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并嚴(yán)重精神疾病;②合并惡性腫瘤;③合并紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病。本研究經(jīng)南方醫(yī)科大學(xué)皮膚病醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(GDDHLS-20150613)。研究對象均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 資料收集 收集研究對象的年齡、性別以及患者臨床診斷等資料。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血不同表型Tfh細(xì)胞 使用EDTA抗凝管采集研究對象外周血5 mL,采用 Ficoll 密度梯度分離法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)。取約1×105個(gè)PBMC,分別加入PerCP-eFluorTM標(biāo)記的CXCR5單克隆抗體、FITC標(biāo)記的CD4單克隆抗體和PE標(biāo)記的ICOS單抗(均購于eBioscience公司), 4 ℃避光標(biāo)記30 min, PBS洗2遍, 200 μL PBS 重懸,轉(zhuǎn)入流式管,用BD FACSCantoTMⅡ流式細(xì)胞儀檢測。每次上機(jī)檢測前,均采用流式校準(zhǔn)微球(BD CS&T research beads)對流式細(xì)胞儀進(jìn)行質(zhì)控。

1.2.3 TRUST滴度檢測方法 采集研究對象外周血4 mL,分離血清,送南方醫(yī)科大學(xué)皮膚病醫(yī)院檢驗(yàn)科,由檢驗(yàn)人員嚴(yán)格按照TRUST試劑盒(上海榮盛生物)說明書操作及判讀結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。組間性別比較采用卡方檢驗(yàn),年齡比較采用單因素方差分析。臨床分組組間不同表型Tfh細(xì)胞水平的總體比較采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn),兩兩比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn),兩兩比較Bonferroni校正后顯著性水準(zhǔn)α=0.012 5,Tfh細(xì)胞與TRUST滴度相關(guān)性采用Spearman相關(guān)進(jìn)行分析。顯著性水準(zhǔn)α=0.05(雙側(cè)),P<0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

共納入121例研究對象。男77例(63.64%),女44例(36.36%),年齡2～76歲,平均(33.00±14.62)歲。各組性別、年齡情況見表1。5組之間性別(2=2.41,P=0.660)、年齡(F=0.67,P=0.617)分布無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表1 各組研究對象性別、年齡情況Table 1 Demographic characteristics of subjects

2.2 外周血不同表型Tfh細(xì)胞在臨床分組中的差異

各臨床分組研究對象外周血不同表型Tfh細(xì)胞比例見表2、圖1。CD4+CXCR5+ICOS+Tfh細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞比例在5組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001),而CD4+CXCR5+和CD4+ICOS+Tfh細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞比例在5組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P值分別為0.559、0.424)。

圖1 各組外周血CD4+CXCR5+ICOS+Tfh細(xì)胞流式細(xì)胞分析的代表性散點(diǎn)圖Figure 1 Representative scatter plots of flow cytometric analysis of CD4+CXCR5+ICOS+Tfh cells in peripheral blood.

表2 各組研究對象外周血不同表型Tfh細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞比例 (%,mean±SD)Table 2 The percentages of CD4+CXCR5+ICOS+ Tfh cells in CD4+ T cells in the five groups (%,mean±SD)

與對照組相比,梅毒治療前患者CD4+CXCR5+ICOS+Tfh細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞比例顯著上升(U=121.00,P<0.001)。與治療前組相比,CD4+CXCR5+ICOS+Tfh細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞比例在治療中組無明顯變化(U=128.50,P=0.039),而在治愈組(U=71.50,P<0.001)和血清固定組(U=84.50,P=0.009)均顯著下降。其余組間無顯著差異(P>0.012 5)。

2.3 外周血不同表型Tfh細(xì)胞的比例與TRUST滴度的相關(guān)性分析

相關(guān)性分析顯示, CD4+CXCR5+ICOS+T細(xì)胞所占CD4+T細(xì)胞比例與TRUST滴度呈正相關(guān)(r=0.30,P<0.01,圖2),CD4+CXCR5+T細(xì)胞所占CD4+T細(xì)胞比例與TRUST滴度無明顯相關(guān)(r=-0.06,P=0.519),CD4+ICOS+T細(xì)胞所占CD4+T細(xì)胞比例與TRUST滴度亦無明顯相關(guān)(r=0.14,P=0.118)。

圖2 TRUST滴度與CD4+CXCR5+ICOS+Tfh細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞比例呈正相關(guān)Figure 2 Correlation between TRUST titers and the percentage of CD4+CXCR5+ICOS+Tfh cells in CD4+T cells.

3 討論

目前人體對梅毒螺旋體感染的免疫學(xué)應(yīng)答機(jī)制尚未被完全闡明,研究表明梅毒患者存在體液免疫功能亢進(jìn),細(xì)胞免疫功能缺陷的現(xiàn)象[13],其外周血CD4+T細(xì)胞水平下降[14]。有研究發(fā)現(xiàn),在人扁桃體中,與CD4+CD45RO+CXCR5-T細(xì)胞相比,CD4+CD45RO+CXCR5+T細(xì)胞可以有效地促進(jìn)IgA和IgG免疫球蛋白的產(chǎn)生,這種細(xì)胞被命名為Tfh細(xì)胞[15-16]。CXCR5是Tfh細(xì)胞最重要的表面標(biāo)記物,在其配體CXCL13的趨化下使Tfh細(xì)胞定位至生發(fā)中心,促進(jìn)B細(xì)胞分化為漿細(xì)胞和記憶型B細(xì)胞。ICOS是Tfh細(xì)胞必不可少的共刺激分子,與B細(xì)胞表面的ICOSL結(jié)合,促進(jìn)Tfh細(xì)胞分泌IL-21進(jìn)一步誘導(dǎo)B細(xì)胞分化為漿細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗體[17-18]。Tfh細(xì)胞是介導(dǎo)體液免疫、促進(jìn)B細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗體的CD4+T細(xì)胞。在慢性乙型肝炎的研究中,Tfh細(xì)胞通過IL-21途徑促進(jìn)HBe血清學(xué)轉(zhuǎn)換[19],Tfh細(xì)胞參與了HBV的清除,敲除慢性乙型肝炎小鼠模型中的Bcl-6基因,可以使小鼠缺失Tfh細(xì)胞且延緩HBV的清除,移植Tfh細(xì)胞能夠促進(jìn)HBV的清除[20]。

本研究利用流式細(xì)胞分析,比較各組外周血CD4+CXCR5+ICOS+Tfh細(xì)胞占外周血CD4+T細(xì)胞比例,結(jié)果顯示,治療前梅毒患者較對照組明顯上升;治療中患者與治療前患者比較無明顯差異,推測原因可能是療程不足引起;治愈組、血清固定組較治療前顯著下降,提示Tfh細(xì)胞參與梅毒自然病程發(fā)生階段的免疫應(yīng)答。分析TRUST滴度與CD4+CXCR5+ICOS+Tfh細(xì)胞比例的關(guān)系,結(jié)果顯示兩者呈正相關(guān)。提示Tfh細(xì)胞可能參與調(diào)控梅毒非特異性抗體的產(chǎn)生,可能與梅毒病程發(fā)展相關(guān)。

CD4+CXCR5+T細(xì)胞被認(rèn)為是記憶型Tfh細(xì)胞[21]。與健康對照相比,病毒性肝炎、艾滋病患者外周血中CD4+CXCR5+T細(xì)胞數(shù)量上升[22-23],且HIV病毒載量與CD4+CXCR5+T細(xì)胞計(jì)數(shù)呈負(fù)相關(guān),說明這種記憶型Tfh細(xì)胞可能參與人體對部分傳染性疾病的免疫應(yīng)答。本研究發(fā)現(xiàn)外周血表型為CD4+CXCR5+、CD4+ICOS+的Tfh細(xì)胞比例在不同臨床分組、不同TRUST試驗(yàn)滴度之間差異未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分析原因一方面可能是本研究納入對象的年齡段較廣,即CD4+CXCR5+Tfh細(xì)胞的比例與年齡有關(guān)[24],不同年齡研究對象基礎(chǔ)免疫力的差異可能掩蓋了CD4+CXCR5+Tfh細(xì)胞比例在梅毒患者中的差異;另一方面是CXCR5可在活化的CD4+T細(xì)胞上短暫表達(dá),但只有Tfh細(xì)胞可穩(wěn)定表達(dá)CXCR5,外周血中部分短暫活化的CD4+T細(xì)胞可能影響了結(jié)果。

綜上所述,本研究顯示未經(jīng)治療的梅毒患者CD4+T細(xì)胞亞群中的CD4+CXCR5+ICOS+Tfh細(xì)胞占外周血CD4+細(xì)胞比例顯著上升,結(jié)果佐證了梅毒患者存在體液免疫功能亢進(jìn)的現(xiàn)象。但Tfh細(xì)胞是否直接參與梅毒抗體生成及病原體清除尚不明確,需進(jìn)一步深入探索。