朱雅倩, 李欣輝, 賈子悅, 陳永鋒

1.安徽醫(yī)科大學(xué)廣東皮膚病臨床學(xué)院,2.南方醫(yī)科大學(xué)皮膚病醫(yī)院,廣東 廣州 510091

天皰瘡是一種慢性復(fù)發(fā)性炎癥性大皰性疾病,主要臨床表現(xiàn)為皮膚和黏膜的紅斑、水皰、糜爛[1]。落葉型天皰瘡(pemphigus foliaceus,PF)是天皰瘡的一種經(jīng)典類型,其水皰僅累及皮膚,黏膜較少受累[2-3]。PF患者血清中存在抗橋粒芯蛋白(desmoglein,DSG)1抗體,其與DSG結(jié)合后導(dǎo)致角質(zhì)形成細(xì)胞之間的黏附喪失,誘導(dǎo)水皰的形成?？笵SG1抗體的產(chǎn)生被認(rèn)為與遺傳、免疫耐受、免疫失衡、病毒感染、藥物等因素相關(guān)[4],但對(duì)于各因素在天皰瘡發(fā)生過程中的具體作用,目前仍缺少清晰的認(rèn)識(shí)。天皰瘡的發(fā)病受到多種基因調(diào)控。HLA-DRB1和HLA-DQB1已被證實(shí)與天皰瘡的發(fā)病相關(guān),TLR2、TLR3、ST18等基因也可能在天皰瘡發(fā)病過程中起著一定作用[5],但具體分子機(jī)制還有待進(jìn)一步探究。目前天皰瘡的治療除了傳統(tǒng)的糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑以外,主要研究集中于靶向B細(xì)胞及IgG抗體,如CD20單抗、新生兒Fc受體(FcRn)拮抗劑、B細(xì)胞激活因子拮抗劑、BTK抑制劑等[6]。PDE4抑制劑及JAK抑制劑在天皰瘡中的應(yīng)用證明了其他通路的小分子藥物在治療天皰瘡中的前景,而各種炎癥信號(hào)通路在天皰瘡中的作用也亟待進(jìn)一步探索。由于實(shí)驗(yàn)技術(shù)的限制,目前天皰瘡的研究主要集中于體外實(shí)驗(yàn),缺少JAK-STAT、Toll-like受體等炎癥通路在天皰瘡中作用的相關(guān)機(jī)制研究。

T細(xì)胞亞群在PV發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵作用已被充分證實(shí)。PV患者外周血中,T細(xì)胞亞群的比例和功能存在異常[7]。CD4+T 淋巴細(xì)胞在病灶皮膚和周圍的組織中表達(dá)明顯上升,釋放白介素4、白介素5、白介素6的CD4+T細(xì)胞是DSG1的反應(yīng)性細(xì)胞[8]。為進(jìn)一步探究CD4+T細(xì)胞在PF發(fā)病過程中的作用,以及與天皰瘡發(fā)病相關(guān)的基因及通路,本研究采用生物信息學(xué)方法篩選出與PF發(fā)病相關(guān)的候選基因,并使用受試者工作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲線判斷候選基因?qū)F的診斷效能,最終確定與PF發(fā)病相關(guān)的關(guān)鍵基因及通路,為PF的進(jìn)一步研究提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 PF患者外周血CD4+ T細(xì)胞數(shù)據(jù)集的獲取

使用關(guān)鍵詞“pemphigus foliaceus,CD4+T cell”在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索PF患者外周血CD4+T 細(xì)胞的基因表達(dá)譜。篩選數(shù)據(jù)集的標(biāo)準(zhǔn)如下：①測(cè)序樣本包括PF患者外周血CD4+T細(xì)胞;②包括病例和對(duì)照;③有可用的處理或原始數(shù)據(jù)供分析。經(jīng)比較和篩選后,研究選取編號(hào)為GSE53873的PF患者外周血CD4+T細(xì)胞基因芯片數(shù)據(jù)集,選取其中10個(gè)未治療的PF患者樣本作為PF組,以及5個(gè)健康對(duì)照作為健康對(duì)照組(health control,HC)[9-10]。

1.2 數(shù)據(jù)的歸一化與標(biāo)準(zhǔn)化處理

為將數(shù)據(jù)歸一化及標(biāo)準(zhǔn)化處理,將獲取的表達(dá)矩陣去除空值比例大于50%的行(基因)和空值比例大于50%的列(樣本),得到的矩陣使用“impute”R軟件包對(duì)缺失值采用最近鄰居法(K-nearest neighbor, KNN)進(jìn)行填充,最后進(jìn)行l(wèi)og2(x+1)轉(zhuǎn)換,得到表達(dá)矩陣[11]。

1.3 差異表達(dá)分析

使用R語(yǔ)言軟件(版本 3.4.6)的“l(fā)imma”包進(jìn)行差異分析,獲得PF組與HC組間的差異基因。差異表達(dá)基因篩選標(biāo)準(zhǔn)為倍數(shù)變化(fold change,FC)≥2[12],P<0.05。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

使用差異基因構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò),將差異基因?qū)隨TRING蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(STRING Version 11.5;https：//string-db.org/),以獲得蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò),并使用Cytoscape軟件進(jìn)行可視化,使用CytoCNA插件中的度值篩選候選基因,篩選度值>9的基因作為候選基因[13]。

1.5 判斷候選基因?qū)F的診斷效能

使用微生信在線工具(http：//www.bioinformatics.com.cn/)中的ROC曲線進(jìn)行分析及可視化[14]。ROC曲線下的面積值(area under ROC curve,AUC)在0.5和1之間。AUC越接近于1,說明診斷效果越好。AUC在 0.5～0.7時(shí)有較低準(zhǔn)確性,AUC在0.7～0.85時(shí)有一定準(zhǔn)確性,AUC在0.85以上提示有較高準(zhǔn)確性。篩選AUC>0.85的候選基因,將其確定為關(guān)鍵基因。

1.6 PF組和HC組關(guān)鍵基因表達(dá)量比較

使用SPSS軟件(版本9.5.0.0)對(duì)PF患者以及HC的候選基因表達(dá)譜進(jìn)行兩個(gè)獨(dú)立樣本的Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,最后使用Graphpad Prism 8.0.2進(jìn)行可視化[15],比較PF組和HC組患者外周血CD4+T細(xì)胞中關(guān)鍵基因的表達(dá)量差異。

1.7 基因功能和通路富集分析

使用R軟件包“clusterProfiler”及“pathview”進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路分析,探索差異基因的生物學(xué)功能。篩選條件為P<0.05[16-19]。

2 結(jié)果

2.1 差異基因分析

將10例PF患者與5例HC患者外周血CD4+T細(xì)胞中的基因表達(dá)量進(jìn)行差異分析,在P<0.05,差異倍數(shù)≥2的情況下,共鑒定了121個(gè)上調(diào)基因和48個(gè)下調(diào)基因,使用火山圖與熱圖進(jìn)行可視化(圖1A、1B)。

圖1 兩組患者差異基因分析 1A：火山圖;1B：熱圖Figure 1 Analysis of differentially expressed genes between the two groups. 1A： Volcanic map; 1B：Heat map.

2.2 構(gòu)建差異基因的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的網(wǎng)絡(luò)

將PF組與HC組的基因差異分析得到的169個(gè)差異基因輸入STRING數(shù)據(jù)庫(kù),構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的網(wǎng)絡(luò),該網(wǎng)絡(luò)共包含82個(gè)節(jié)點(diǎn),142條邊。使用Cytoscape中的CytoNCA插件計(jì)算PPI網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)的拓?fù)涮卣鲄?shù),篩選網(wǎng)絡(luò)中度值大于9的基因,最終得到9個(gè)候選基因：CD14、CSF1R、LILRB2、CXCL10、TLR7、CCR5、IFNB1、OAS1、OASL,如圖2所示,顏色越深說明該基因在該網(wǎng)絡(luò)中直接連接度越高。

圖2 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖Figure 2 The protein-protein interaction network.

2.3 CXCL10及OAS1為PF發(fā)病相關(guān)的關(guān)鍵基因

為判斷候選基因的診斷效能,繪制ROC曲線并計(jì)算9個(gè)候選基因的AUC。9個(gè)候選基因的AUC分別為：CXCL10(AUC=0.86)、OAS1(AUC=0.86)、OASL(AUC=0.82)、CD14(AUC=0.82)、LILRB2(AUC=0.80)、TLR7(AUC=0.76)、CCR5(AUC=0.76)、CSF1R(AUC=0.74)、IFNB1(AUC=0.66)。結(jié)果提示CXCL10(AUC=0.86)及OAS1(AUC=0.86)對(duì)PF具有較高的診斷價(jià)值。因此,確定CXCL10及OAS1為診斷PF發(fā)病相關(guān)的關(guān)鍵基因(圖3)。Wilcoxon秩和檢驗(yàn)結(jié)果顯示：PF患者CXCL10及OAS1的表達(dá)量明顯高于HC組,兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖4)。

圖3 兩組外周血CD4+ T細(xì)胞中CXCL10及OAS1的ROC曲線Figure 3 ROC curves for CXCL10 and OAS1 in peripheral blood CD4+ T cells from PF and HC groups.

圖4 兩組外周血CD4+ T細(xì)胞中CXCL10及OAS1的表達(dá)量Figure 4 Expression of CXCL10 and OAS1 in peripheral blood CD4+ T cells in PF and HC groups.

2.4 差異基因的功能富集分析

將PF組與HC組之間的差異表達(dá)基因進(jìn)行通路富集分析,GO富集分析顯示,與HC組相比,PF組的差異基因主要富集在T細(xì)胞分化、T細(xì)胞活化、白細(xì)胞分化與代謝等多個(gè)通路(圖5A)。KEGG富集分析結(jié)果表明,差異基因主要富集在造血細(xì)胞譜系、TOLL樣受體信號(hào)通路、急性髓系白血病、破骨細(xì)胞分化、吞噬體、嘧啶代謝、脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化、細(xì)胞因子受體相互作用等方面(圖5B)。通路富集分析提示CXCL10主要與TOLL樣受體信號(hào)通路、COVID-19感染、細(xì)胞因子相互作用相關(guān),而OSA1主要與病毒感染、Ⅰ型干擾素信號(hào)通路等相關(guān)。

圖5 PF組與HC組之間差異表達(dá)基因的富集分析 5A：GO富集分析;5B： KEGG分析Figure 5 Enrichment analysis of differentially expressed genes in the PF and HC groups. 5A：GO enrichment analysis; 5B：KEGG analysis.

3 討論

目前已有較多研究證明CD4+T細(xì)胞在天皰瘡及其他自身免疫性疾病中的重要作用[20-22]。PV患者外周血中單個(gè)核細(xì)胞(periphreal blood mononuclear cell, PBMC)中CD4+T細(xì)胞對(duì)DSG3抗原產(chǎn)生反應(yīng),而CD8+T細(xì)胞對(duì)DSG3抗原無反應(yīng),提示CD4+T細(xì)胞是參與這些患者自身免疫應(yīng)答的主要T細(xì)胞群[23]。當(dāng)PBMC中的CD4+T細(xì)胞耗竭時(shí),抗DSG3抗體的產(chǎn)生受到了抑制[24]。以上研究證明了CD4+T細(xì)胞在抗DSG3抗體產(chǎn)生過程中的重要作用。Lin等[8]研究表明PF患者體內(nèi)存在對(duì)DSG1特異性反應(yīng)的CD4+T細(xì)胞,這些CD4+T細(xì)胞可以分泌白介素4、白介素6等,并且可能會(huì)刺激自身免疫B細(xì)胞產(chǎn)生抗DSG1自身抗體,表明CD4+T細(xì)胞在DSG1抗體產(chǎn)生的過程中也不可或缺。CD4+T細(xì)胞作為天皰瘡抗體產(chǎn)生過程中的一個(gè)重要部分,是天皰瘡研究中的一個(gè)重要領(lǐng)域,但關(guān)于天皰瘡患者外周血CD4+T細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組研究仍然較少。

本研究從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選PF患者外周血CD4+T細(xì)胞的基因表達(dá)譜,通過Limma差異分析、基因功能和通路富集分析、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析等多種生物信息學(xué)分析,最終將CXCL10及OAS1確定為與PF發(fā)病相關(guān)的關(guān)鍵基因。CXCL10由免疫細(xì)胞、上皮細(xì)胞等分泌,是單核細(xì)胞和T細(xì)胞的趨化因子,可促進(jìn) T 細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附[25-27]。CXCL10已被證實(shí)與多種免疫性疾病相關(guān),包括類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合征、系統(tǒng)性硬化癥和特發(fā)性炎癥性肌病等[28-30]。2021年的一項(xiàng)動(dòng)物研究表明,與健康對(duì)照組相比,犬類天皰瘡病變組織中的T細(xì)胞和B細(xì)胞增多,并且CXCL10表達(dá)顯著上調(diào)[31]。鑒于犬天皰瘡與人類天皰瘡具有相似的臨床特征和變異,CXCL10在人類天皰瘡的發(fā)病過程中也可能起著重要作用[32]。目前暫缺少CXCL10在PF患者外周血CD4+T細(xì)胞中的相關(guān)研究。本研究結(jié)果提示,與正常人相比,PF患者外周血CD4+T細(xì)胞中CXCL10基因表達(dá)顯著上調(diào),提示CXCL10可能與PF的發(fā)病相關(guān),是PF發(fā)病的關(guān)鍵基因。

OAS1是一種干擾素誘導(dǎo)蛋白,在先天細(xì)胞抗病毒反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用,并與細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞凋亡有關(guān)[33]。既往關(guān)于OAS1的研究主要涉及系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、干燥綜合征等多種自身免疫性疾病[34-35]。本研究顯示,PF患者的外周血CD4+T細(xì)胞中,OAS1的表達(dá)顯著上調(diào),與 HC組相比,存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,且ROC曲線提示OAS1具有較高的診斷效能(AUC=0.86),提示OAS1可能與PF的發(fā)病相關(guān),是PF發(fā)病的關(guān)鍵基因。

綜上所述,本研究利用多種生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)PF患者外周血CD4+T細(xì)胞基因芯片數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析,最終確定CXCL10及0AS1為與PF發(fā)病相關(guān)的關(guān)鍵基因。CXCL10主要與TOLL樣受體信號(hào)通路、COVID-19感染、細(xì)胞因子相互作用相關(guān),而OSA1主要與病毒感染、Ⅰ型干擾素信號(hào)通路等相關(guān)。