曹雪, 楊冰燕, 張弘揚, 董靈娣, 劉昱昕, 喻楠

1.巴彥淖爾市醫(yī)院,內(nèi)蒙古 臨河 015000;2.寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院,寧夏 銀川 750000

皮膚鱗狀細胞癌(cutaneous squamous cell carcinoma,cSCC)是一種以異形鱗狀細胞惡性增殖為主要病理學特征,多種理化因素共同參與的皮膚腫瘤,其發(fā)病率呈逐年上升趨勢[1-2]。光線性角化病(actinic keratoses,AK)與cSCC關(guān)系密切,二者系同一病譜,被認為是cSCC發(fā)生浸潤的癌前階段[3]。AK、cSCC的發(fā)生與發(fā)展是多基因、多通路的復雜作用結(jié)果,其具體發(fā)病機制尚不完全明確。

抑制素β-A(INHBA)是轉(zhuǎn)化生長因子β超家族的一個成員,具有高度保守性,廣泛參與發(fā)育、生殖等各個環(huán)節(jié)。近年來,研究發(fā)現(xiàn)INHBA的高表達與惡性腫瘤緊密相關(guān)?，F(xiàn)已證實,INHBA基因為原癌基因,在包括卵巢癌、直腸癌、頭頸鱗癌等多種惡性實體腫瘤中過表達。INHBA能促進腫瘤細胞增殖與分化,同時也是評估腫瘤不良預后的重要指標之一[4-6],目前已成為惡性腫瘤治療的新研究靶點。然而,有關(guān)INHBA與cSCC的相關(guān)性尚未完全闡明。因此,本研究通過免疫組化、RT-qPCR及Western blot的方法檢測INHBA在cSCC組織中的表達水平,并與在AK、正常皮膚組織中的表達進行比較,以探討其在cSCC發(fā)生、發(fā)展中的作用及可能機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年1月—2022年5月就診于寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院皮膚科的AK及cSCC的患者為研究對象。納入標準：①組織病理證實為光線性角化病或皮膚鱗狀細胞癌[7];②取材前未行系統(tǒng)或局部治療。排除標準：①伴有基底細胞癌、惡性黑色素瘤等其他皮膚惡性腫瘤病史者;②臨床資料留存不完整者。最終納入AK、cSCC患者皮損組織各30例。另外納入同時段就診于我院的17例行美容手術(shù)的正常人表皮組織作為正常對照組(NS組)。3組間性別、年齡差異無統(tǒng)計學意義(表1)。本研究已通過本院醫(yī)學倫理委員會審批,所有患者均知情同意。

表1 三組一般資料比較Table 1 Demographic characteristics

1.2 主要試劑和儀器

INHBA兔抗人多克隆抗體(美國Abcam公司),反轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物公司),兔二步法試劑盒(北京中杉金橋公司),SDS凝膠配置試劑盒(江蘇凱基生物公司)。電泳儀(美國Bio-Rad公司),分光光度儀(日本Hitachi公司),熒光PCR儀(瑞士Roche公司),顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 免疫組化法檢測INHBA在3組中的表達水平 將新鮮皮損組織石蠟包埋后制片,脫蠟處理后過梯度乙醇水化,抗原熱修復后,加入適量過氧化氫,PBS沖洗3次后滴加稀釋后的一抗(稀釋比1 ∶400),37 ℃溫箱孵育3 h。滴加反應增強液,沖洗后滴加二抗,置于37 ℃溫箱孵育40 min;滴加DAB顯色劑,使用蘇木精將切片復染,用鹽酸酒精分化置于PBS缸中沖洗返藍;將切片過梯度乙醇脫水,用中性樹膠做封片處理。陽性細胞判定：INHBA陽性細胞表現(xiàn)為細胞質(zhì)/核內(nèi)出現(xiàn)黃染顆粒。使用光學顯微鏡隨機觀察5個視野,依據(jù)染色深淺程度及陽性細胞所占百分比判讀結(jié)果。判定標準：無表達(-)：無或<5%陽性細胞;低表達(+)：淡黃,陽性細胞占5%～29%;中表達(++)：黃色,陽性細胞占30%～59%;高表達(+++)：棕黃色,陽性細胞≥60%。其中,高表達(+++)判定為強陽性表達。

1.3.2 RT-qPCR 檢測INHBA mRNA在3組中的表達水平 將各組織充分研磨、裂解,加入氯仿、異丙醇,提取RNA沉淀,并測量各樣本的OD值。建立10 μL的反應體系(5×預混液 2 μL,總RNA 2 μL,RNase Free dH2O 6 μL),利用得到的RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。建立20 μL反應體系(PCR上游引物、下游引物各0.8 μL,ROX 0.4 μL,cDNA 2 μL, ddH2O 6 μL,SYBR 10 μL),置于PCR儀中進行擴增反應(預變性95 ℃ 30 s,1個循環(huán),95 ℃ 5 s,60 ℃ 34 s,共40個循環(huán))。INHBA基因引物序列為F：5′-AAGAAGGGCGGAGGTGAAGG-3′;R：5′-GGCGATGAGGGTGGTCTTCA-3′(上海生工設計)。采用2-ΔΔCt法分別計算各組mRNA相對表達量。

1.3.3 Western blot法檢測INHBA蛋白在3組中的表達水平 提取組織總蛋白,依次測定各組蛋白含量,將帶膠的玻璃板固定于電泳槽,依次加入蛋白Marker、NS組、AK組、SCC組蛋白樣品(Marker 5 μL,余蛋白樣品10 μL)。行SDS-PAGE凝膠電泳(80 V,30 min后轉(zhuǎn)120 V,60 min)。采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜(轉(zhuǎn)膜條件：240 V,300 mA,90 min)。加入一抗及內(nèi)參(一抗稀釋比例為1 ∶1 000),4 ℃過夜。第二天,復溫后孵育二抗(二抗稀釋比例1 ∶5 000)1 h,使用凝膠成像儀曝光,用Image J 1.53e軟件分析各目的蛋白條帶灰度值。計算各組蛋白相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件包分析數(shù)據(jù)。NS、AK、cSCC三組間mRNA及蛋白相對表達量的比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用Tukey檢驗。INHBA陽性表達率分布的比較采用2檢驗,不滿足條件時使用雙側(cè)Fisher確切概率法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化法檢測INHBA的表達

免疫組化結(jié)果顯示,INHBA陽性細胞在AK中定位于不典型增生角質(zhì)細胞的胞質(zhì)/核,表現(xiàn)為黃色顆粒沉積;在cSCC中定位于腫瘤細胞的胞質(zhì)/核,表現(xiàn)為棕黃色顆粒沉積。INHBA陽性表達率在NS、AK及cSCC中分別為23.53%、66.67%及86.67%,差異具有統(tǒng)計學意義(2=27.10,P=0.001)。進一步進行兩兩組間比較發(fā)現(xiàn),與NS組相比,AK組2=7.82,P=0.038)及cSCC組2=21.91,P<0.001)的表達量增高,差異具有統(tǒng)計學意義,且cSCC組高于AK組(2=10.69,P=0.013,圖1,表2)。

圖1 免疫組化檢測INHBA在3組組織中的表達(400×)Figure 1 Immunohistochemistry of INHBA in NS,AK and cSCC tissues(400×).

表2 INHBA在NS、AK及cSCC組織中的表達情況 (例)Table 2 Expression of INHBA in the Normal,AK and cSCC tissues (Case)

2.2 RT-qPCR檢測INHBA mRNA表達

RT-qPCR結(jié)果顯示,NS、AK及cSCC中的INHBA mRNA相對表達量依次為1.097±0.083、1.328±0.041、1.731±0.064,3組比較差異具有統(tǒng)計學意義(F=48.53,P<0.001);AK組、cSCC組INHBA mRNA相對表達量均較NS組升高(P=0.028,P<0.001);cSCC組表達水平較AK組升高(P=0.002,圖2)。

圖2 RT-qPCR檢測3組中INHBA mRNA相對表達Figure 2 Relative expression levels of INHBA mRNA.

2.3 Western blot檢測INHBA蛋白表達

Western blot結(jié)果顯示,在NS組、AK組及cSCC組中,INHBA蛋白相對表達量依次為0.850±0.011、0.925±0.020、1.050±0.013,3組比較差異具有統(tǒng)計學意義(F=86.62,P<0.001);AK、cSCC組INHBA蛋白相對表達量均高于NS組(P=0.006,P<0.001);cSCC組表達量高于AK組(P<0.001,圖3)。

圖3 Western blot 檢測3組中INHBA蛋白的表達Figure 3 Relative expression levels of INHBA protein.

3 討論

目前cSCC發(fā)病率逐年上升,據(jù)Brougham等預測[8],到2030年在歐洲國家該病發(fā)病率將會是當前水平的兩倍[8]。另一項在亞洲人群中的流行病學調(diào)查發(fā)現(xiàn),與印度及馬來西亞人相比,中國人罹患皮膚腫瘤的概率及風險更高[9]。炎癥、免疫抑制、角質(zhì)細胞周期失調(diào)及氧化應激均為參與其發(fā)病的主要環(huán)節(jié)[10-12],但具體發(fā)病機制尚不明確。

抑制素(inhibin, INH)是性腺分泌的一種糖蛋白激素,是由不同亞基組成的二聚體,其中INHBA的主要生理功能為激活和抑制促卵泡激素分泌,故最初發(fā)現(xiàn)其在卵巢癌中的致癌作用。后來越來越多的研究證實,INHBA除參與生殖系統(tǒng)腫瘤外,在胃腸道腫瘤(如食管癌、胃癌、結(jié)直腸癌)及肺癌、頭頸鱗癌等實體腫瘤中亦發(fā)揮致癌作用[13-15]。INHBA可通過調(diào)控腫瘤細胞增殖遷移、促進上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、修飾表觀遺傳、介導免疫逃逸等多種途徑參與腫瘤的增殖與侵襲。近年來,成為惡性腫瘤研究的新靶點[16-17],但目前INHBA在AK及cSCC中的相關(guān)研究報道尚少。

本研究從組織層面證實了INHBA與AK及cSCC的相關(guān)性。免疫組化實驗結(jié)果表明INHBA陽性細胞在AK中定位于不典型增生角質(zhì)細胞的胞質(zhì)/核,表現(xiàn)為黃色顆粒沉積;在cSCC中定位于腫瘤細胞的胞質(zhì)/核,表現(xiàn)為棕黃色顆粒沉積;INHBA陽性表達率在NS、AK及cSCC組織中依次增高,三組間存在差異性。研究表明INHBA上調(diào)與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(TNM)分期、組織學分級和人乳頭瘤病毒(HPV)狀態(tài)及總體生存率顯著相關(guān),并證實INHBA過表達是判讀腫瘤不良預后因素的獨立指標,認為INHBA可作為腫瘤病理和分子診斷的生物標志物[18]。本研究還顯示,從正常皮膚到癌前期病變到皮膚鱗癌形成的過程中,INHBA的相對表達量依次增加,INHBA在cSCC中呈高表達狀態(tài)。故此推測INHBA可能與cSCC形成相關(guān),并有望成為腫瘤治療的靶點及判斷預后的指標。

INHBA調(diào)控腫瘤發(fā)生侵襲主要是通過TGF-β/Smad信號通路完成[19]。例如,在胃癌中,過表達的INHBA可招募并活化Smad4蛋白從而轉(zhuǎn)移TGF-β/Smad信號進入細胞核而發(fā)揮作用[20]。靶向沉默INHBA基因可阻斷TGF-β的信號傳導,進而下調(diào)PI3K/Akt通路的活性,導致cyclinD1減少和細胞周期停滯從而抑制大腸癌的增殖[21]。本研究在小樣本的組織水平上驗證了INHBA與cSCC的相關(guān)性,但INHBA如何影響cSCC的發(fā)生發(fā)展還有待研究。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)INHBA在cSCC中高表達,與cSCC的發(fā)生發(fā)展有關(guān),但介于腫瘤調(diào)控、演變的復雜性,其具體機制仍有待深入研究。本研究為將來cSCC的靶向治療奠定了實驗基礎(chǔ)。