張程杰

(1.田邊三菱制藥研發(fā)(北京)有限公司上海分公司,上海 200030;2.上海國廣生物科技有限公司,上海 201801)

柑橘(CitrusreticulataBlanco)是蕓香科(Rutaceae)、柑橘屬草本植物,為熱帶、亞熱帶水果。柑橘是全世界最大批量的水果作物,在我國已具有4000余年的栽培歷史。隨著國內(nèi)水果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,柑橘種植面積逐年增加。當(dāng)柑橘產(chǎn)業(yè)規(guī)模擴大的同時,柑橘病蟲害也給其發(fā)展帶來了不可忽視的負(fù)面影響,甚至限制了柑橘產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步擴大。而柑橘潰瘍病(Citrus bacterial canker)是一個嚴(yán)重影響柑橘生產(chǎn)的病理因素,它廣泛傳播于全球各柑橘種植區(qū)域,給柑橘產(chǎn)業(yè)帶來了不可估量的損失[1]。此病的病原菌主要有3種,分別是柑橘黃單胞桿菌柑橘亞種(Xanthomonascitrisubsp.citri)、棕色黃單胞萊檬亞種(X.citrisubsp.aurantifolii)和苜蓿黃單胞枳柚亞種(X.alfalfasubsp.citrumelonis),這三種病菌分布地區(qū)各不相同,在中國致使柑橘潰瘍病發(fā)生的罪魁禍?zhǔn)字饕歉涕冱S單胞桿菌[2]。該病一般會直接造成柑橘苗木染病部位的枝葉、果實表面產(chǎn)生火山狀病斑,感染較為嚴(yán)重時,會出現(xiàn)葉片脫落、枝椏枯萎、果實非自然掉落,并使果實減產(chǎn),質(zhì)量受損。而此病菌如果在柑橘產(chǎn)地范圍性擴散,將會直接或間接的使該區(qū)域的所有柑橘產(chǎn)業(yè)遭受巨大的負(fù)面沖擊,果農(nóng)將承受不可估量的損失[3]。

為防止柑橘潰瘍病所造成的柑橘產(chǎn)業(yè)停滯甚至下滑等嚴(yán)重后果,對該病的防治刻不容緩。而目前暫沒有能夠完全抑制柑橘黃單胞桿菌徹底根除柑橘潰瘍病的技術(shù)。化學(xué)方法是當(dāng)前最為普及的一種防治手段,通常是對柑橘施以包括銅制劑、農(nóng)用抗生素、噻唑類和微生物制劑等防治藥劑。此方法雖卓有成效,但其對環(huán)境如土壤、水體的破壞和污染等負(fù)面影響已不容忽視[1]。因此,一種新的、破壞更小、效果優(yōu)良的柑橘潰瘍病技術(shù)—生物防治技術(shù)應(yīng)運而生。柑橘潰瘍病的生物防治是使用生物代謝產(chǎn)物或基因異源表達(dá)等,提高植株抗病性,限制潰瘍病菌的生存空間,達(dá)到抑制病原菌或防止菌株侵染目的的一種環(huán)境友好型技術(shù)。隨著研究的深入,已有越來越多的生物手段用于柑橘潰瘍病的防治,本文對近年來的一些柑橘潰瘍病侵染機理與生物防治方式進(jìn)行綜述,以期能為柑橘潰瘍病的進(jìn)一步防治研究提供參考,為推進(jìn)高效、科學(xué)治理柑橘潰瘍病,促進(jìn)柑橘行業(yè)的發(fā)展做出貢獻(xiàn)。

1 柑橘潰瘍病的發(fā)生與傳播

柑橘潰瘍病是由柑橘黃單胞菌亞種引起的一種檢疫傳染病。柑橘品種及其親緣品種對柑橘潰瘍病的易感性各有不同,但大多數(shù)商業(yè)化種植的柑橘品種是中至高度易感宿主。柑橘潰瘍病菌主要以感病植株的枝葉以及主干為再侵染源,病菌寄生于植株的病斑中,并且能夠在其中蟄伏幾年。待到氣候回暖、空氣濕潤的春天時節(jié),病菌在寄主體內(nèi)迅速繁衍,致使表皮組織腫脹破裂,菌膿從裂口滲出,病菌憑借風(fēng)雨、昆蟲以及枝葉間的來回摩擦等方式傳播到健康柑橘植株上,而發(fā)病植株會在木栓化后死亡[4]。病菌會利用自身的鞭毛通過氣孔或受傷部位感染植物體,因此有枝椏斷裂、表皮受損的柑橘植株更容易遭到病菌的侵染,此外,亞洲潛葉蛾(Phyllocnistiscitrella)的啃食會導(dǎo)致植株感染風(fēng)險直線上升。而由于病菌的潛伏性,染病植株難以在第一時間被發(fā)現(xiàn)或被檢查出來,待到來年氣候等條件適宜時,病菌又開始增殖、傳播,如此循環(huán)往復(fù),柑橘潰瘍病一直得不到控制,從而使得更多苗木受害,造成難以估量的損失[2]。

2 生物防治方法

2.1 植物源殺菌劑

植物源殺菌劑是一種或多種來自植物體內(nèi)的次生代謝產(chǎn)物,或通過在植物生產(chǎn)過程中自然形成的物質(zhì),用作種植行業(yè)的殺蟲、消毒以及除草制劑,具有生物活性高、目標(biāo)性強以及對非靶標(biāo)生物安全等優(yōu)點,且毒性低、可分解、不易形成耐藥性[1]。廖石榴等[5]曾采用莧菜乙酸乙酯提取物對柑橘潰瘍病菌進(jìn)行了處理,檢測處理后的柑橘潰瘍病菌活性以及幾種關(guān)鍵酶的抗菌能力。研究發(fā)現(xiàn),莧菜乙酸乙酯提取物使柑橘潰瘍病菌的菌體皺縮,發(fā)生了嚴(yán)重形態(tài)變化,從而打破了菌體的正常保護(hù)功能,并造成細(xì)胞質(zhì)內(nèi)蛋白質(zhì)等物質(zhì)發(fā)生外泄的現(xiàn)象,進(jìn)而使病原菌發(fā)育和生殖遭到巨大破壞。根據(jù)該實驗結(jié)果可知曉,莧菜乙酸乙酯提取物對柑橘潰瘍病菌有良好的抑制和致死功效,可以進(jìn)一步嘗試對感病或健康柑橘植株施加該物質(zhì),研究其在農(nóng)田等自然環(huán)境下對柑橘潰瘍病的實際治療或者預(yù)防能力,并研究該物質(zhì)是否會導(dǎo)致負(fù)面效果的產(chǎn)生以及具體產(chǎn)生何種負(fù)面效果,進(jìn)而研發(fā)出新型的植物來源抗菌、除菌農(nóng)用藥劑。此外,在自然界中的復(fù)雜生態(tài)環(huán)境中,植物多種多樣,這其中能夠?qū)儾【a(chǎn)生抑制或消滅功能的植物及其產(chǎn)生的代謝物同樣種類龐雜,未來或可以在這些未經(jīng)探索的植物上研究它們產(chǎn)生的物質(zhì)對柑橘潰瘍病的治療或抑制功效。

2.2 基因工程

隨著基因工程的發(fā)展與深入研究,以及一些柑橘潰瘍病抗病基因的發(fā)現(xiàn),為柑橘潰瘍病生物防治創(chuàng)造了新的方式。該技術(shù)可通過控制植物自身基因的表達(dá)(一般為抗病基因的過表達(dá))來提高對病菌的抵抗能力,也可以通過異源表達(dá)對柑橘潰瘍病菌具有抗性的基因,從而使植株產(chǎn)生抗病功能。李強等[6]從甜橙中克隆了1個NBS-LRR基因CsNBS-LRR,NBS-LRR蛋白在病原體識別和防御反應(yīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中有著至關(guān)重要的功效,該基因在晚錦橙中過表達(dá),以驗證其功能。經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn),該基因受潰瘍病菌誘導(dǎo)而表達(dá)水平上調(diào)且在柑橘高感品種群體中水平下調(diào),轉(zhuǎn)基因晚錦橙機體內(nèi)與水楊酸合成有密切關(guān)聯(lián)的基因轉(zhuǎn)錄水平顯著上升,表明CsNBS-LRR的過量表達(dá)能夠有效通過調(diào)節(jié)柑橘中水楊酸信號通路來提升柑橘機體自身對潰瘍病的抵抗能力。因此,CsNBS-LRR能夠被考慮用作柑橘分子育種基因的候選基因之一,來研究其對潰瘍病的防治效能。不過,或許是因為柑橘潰瘍病滋生、發(fā)展過于復(fù)雜,亦或者是由于CsNBS-LRR不是防治潰瘍病的主要基因,此項實驗沒能成功培育出對柑橘潰瘍病產(chǎn)生免疫功能的柑橘植株。Omar等[4]通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù),利用綠色熒光蛋白(GFP)和水稻抗黃單胞菌基因Xa21的cDNA構(gòu)建的pAO3基因,對水稻的原生質(zhì)體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化,構(gòu)建了含有水稻抗黃單胞菌基因Xa21的‘W. 默科特’寬皮柑橘植株,轉(zhuǎn)基因植株接種柑橘潰瘍病病原菌后與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓晗嗾?病斑數(shù)量和病斑內(nèi)細(xì)菌數(shù)量都有減少,表明這些轉(zhuǎn)基因品系的抗病性均有提升。并且,該轉(zhuǎn)基因植株已經(jīng)實地場地種植,以評估其園藝性狀和抗病性。

柑橘中響應(yīng)柑橘潰瘍病菌侵染的原生基因和及其構(gòu)建的防御體系不止NBS-LRR,而來源于其他植物或微生物中的抗病基因更是繁多,這些已被發(fā)現(xiàn)或未發(fā)現(xiàn)的柑橘抗病基因的具體種類和作用機制等待我們的探索,并進(jìn)一步研究增強它們應(yīng)對柑橘潰瘍病菌的能力。

2.3 微生物防治

植物體內(nèi)存在著大量的微生物資源,它們長期生活在植物中,能與宿主和諧共處,而不會引起宿主植物產(chǎn)生明顯的病理反應(yīng),它們還可以通過生理代謝形成與宿主產(chǎn)物相同或相似的物質(zhì)。相較于暴露于陽光直射等糟糕的環(huán)境條件下的細(xì)菌,植物內(nèi)生菌有著充足的生命活動所需的各類物質(zhì),且受到植物組織的保護(hù),其生存條件更加的優(yōu)渥、穩(wěn)定,因而能有效地抑制病原菌的入侵或能提高宿主的抗病能力,具有獨特的生物防治效能。目前已發(fā)現(xiàn)的能夠阻抑柑橘潰瘍病菌侵染的微生物有枯草芽孢桿菌、草生歐文氏菌、熒光假單胞菌等[7]。顏楨靈等[8]利用柑橘抗病品種的正常植株進(jìn)行組織培養(yǎng)實驗,得到了一定數(shù)量內(nèi)生真菌,采用帶毒平板涂布法測定內(nèi)生菌乙酸乙酯提取物是否具有阻抑柑橘潰瘍病菌感染的功效,經(jīng)實驗得知大部分的菌株都能夠阻抑病菌的生長繁殖,由此可知柑橘抗病植株的內(nèi)生菌不光是種類繁多,它們的代謝產(chǎn)物也大都能夠遏止柑橘潰瘍病菌的繁殖甚至使其死亡。不過,由于實驗中柑橘品種、采集時間地點、及操作方法等多方面的因素影響,該實驗分離的菌株數(shù)量明顯小于前人報道的從柑橘中分離的內(nèi)生菌數(shù)量,也沒有考慮內(nèi)生菌的組成情況及其抗菌能力與植株自身抗病能力之間的關(guān)系,后續(xù)可從這些方面繼續(xù)將研究深入,探索更多的成果。

柑橘抗病品種是很好的抗柑橘潰瘍病內(nèi)生菌的來源,但植物的種類多種多樣,且微生物可生存于世界的各個角落,如土壤、水體、動植物甚至空氣,它們的種類也各異,比如自然界廣泛存在的芽孢桿菌、假單孢菌,以及一些生防放線菌、生防真菌,甚至是噬菌體都可能對桿菌潰瘍病菌產(chǎn)生拮抗作用,如表1所示,這為后續(xù)的研究方向提供了更多的選擇。

表1 對柑橘潰瘍病菌有拮抗作用的微生物

2.4 殼聚糖

殼聚糖(chitosan, CTS), 化學(xué)名稱為聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-B-D葡萄糖, 可從蠶蛹、蛋殼以及海生生物的貝殼中提取,是甲殼素脫乙酰化后的產(chǎn)物,是自然界中僅有的聚陽離子多糖, 在醫(yī)療保健、環(huán)保、食品、飼料等眾多領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用[9]。殼聚糖對細(xì)菌、真菌和病毒表現(xiàn)出良好的抑制作用,且對哺乳動物低毒,生物相容性好、易于降解,因而被廣泛研究作為抗微生物制劑。

岑銘松[10]等用平板菌落計數(shù)法評價不同粘度殼聚糖對柑橘潰瘍病菌的殺菌效果,得出3種粘度殼聚糖對柑橘潰瘍病的殺菌能力大小依次為:粘度12 >粘度100 >粘度20,且粘度12的殼聚糖處理0.5 h就可完全將柑橘潰瘍病菌殺滅。根據(jù)此實驗可知,殼聚糖在防治柑橘潰瘍病領(lǐng)域具有一定的潛力。

殼聚糖的抑菌效果受其本身性質(zhì),如分子量、晶體外觀和脫乙酰的程度大小等因素的影響,而且殼聚糖的分子量大小直接影響殼聚糖的理化性質(zhì)和生理活性。此外,時間、濃度等因素的變化也同樣會對實驗的最終結(jié)果造成影響。上述實驗考慮的影響因素不夠全面,后續(xù)可將多方面的因素加入到實驗中,以求得到更準(zhǔn)確、有效殼聚糖抑菌濃度和條件,為柑橘潰瘍病提供新的防治技術(shù)。

3 總結(jié)與展望

柑橘潰瘍病日趨嚴(yán)重,一旦爆發(fā)柑橘潰瘍病,會致使柑橘產(chǎn)業(yè)發(fā)展進(jìn)程緩慢,果農(nóng)收入減少,甚至對柑橘及其附加產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟效益帶來巨大損失。目前的化學(xué)防治手段雖行之有效,但農(nóng)藥殘留、耐藥性增強等負(fù)面影響也較為顯著,而生物防治技術(shù)沒有這方面的劣勢,因此,研究并選用生物手段來進(jìn)行柑橘潰瘍病的防治是大勢所趨。上文總結(jié)的4類生物防治技術(shù)中,雖已探明對柑橘潰瘍病菌有防治作用,但還有待繼續(xù)研究改進(jìn),例如微生物防治中,各類微生物的次生代謝產(chǎn)物尚不明確,對柑橘潰瘍病菌起抑制或滅殺作用的活性成分還未分離純化,因此,這些菌類的具體作用機制也不能確定。此外我國對微生物防治研究范圍不廣,層次不深,大部分微生物防治技術(shù)只停留于實驗階段,距離實地測試或應(yīng)用還有一段距離。同樣的,殼聚糖的抑菌機制并沒有統(tǒng)一定論,也未進(jìn)行農(nóng)田實地抗病實驗,其真實抗病能力有待進(jìn)一步探究。

現(xiàn)階段,柑橘潰瘍病的生物防治技術(shù)雖然還不成熟,但可以沿著已有的思路繼續(xù)摸索,并在此基礎(chǔ)上推陳出新,為更好的防治柑橘潰瘍病菌,促進(jìn)柑橘潰瘍病生防技術(shù)的開發(fā)應(yīng)用及柑橘產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展,筆者總結(jié)出以下幾點,以供參考:①柑橘潰瘍病潛伏期長,有時很難判定植株是否染病,因此可針對潰瘍病菌研發(fā)便捷快速的檢測技術(shù),如此可在潰瘍病爆發(fā)前將其扼殺于搖籃之中。②針對植物源殺菌劑與微生物防治技術(shù),因其來源廣泛,獲取較為容易,但現(xiàn)階段研究層面不深,其作用機制需要有深入的研究,以期早日研發(fā)出適用的抗菌劑。③各類技術(shù)各有其優(yōu)劣,如若單個技術(shù)達(dá)不到抗菌要求,可考慮多種技術(shù)綜合使用,如轉(zhuǎn)基因植株預(yù)防病菌侵染,各類生物抗菌劑滅殺病菌。④由于生物防治技術(shù)大都止于實驗室,可考慮加強田間實驗,廣泛測試自然中的諸多因素對實驗結(jié)果的影響,以求更精確合理的實驗結(jié)果。⑤針對潰瘍病菌的傳播因素和途徑,或可切斷其傳染源,諸如雜草、昆蟲此類。