劉想晴 程旺興 秦亞東

(1安徽中醫(yī)藥高等?？茖W校藥學系 安徽蕪湖 241000；2安徽中醫(yī)藥大學藥學院 安徽合肥 230012)

白及始載于《神農本草經》[1]，藥用歷史悠久，療效顯著，來源于蘭科植物白及Bletilla striata(Thunb.)Reichb.f.的干燥塊莖；具有收斂止血，消腫生肌的功效，常用于咯血，吐血，外傷出血，瘡瘍腫毒，皮膚皸裂[1]。白及中主要含有2-異丁基蘋果酸葡萄糖氧基芐酯類、聯芐類、蒽醌類、螺環(huán)烷甾類皂苷、菲類、葡萄糖苷類、類胡蘿卜素等成分，其中2-異丁基蘋果酸葡萄糖氧基芐酯類是蘭科植物含有的具有特殊結構的化合物[3-5]。

白及應用廣泛，主要集中在醫(yī)藥、美容、保健等領域，市場需求量較大，資源相對緊缺，導致大量混偽品出現。目前，市場上出現的白及混偽品統稱為“水白及”，據文獻記載，“水白及”多來源于蘭科天麻屬(Gastrodia)、杜鵑蘭屬(Cremastra)、美冠蘭屬(Eulophia)、筒瓣蘭屬(Anthogonium)、舌唇蘭屬(Platanthera)、獨蒜蘭屬(Pleione)、美冠蘭屬，百合科黃精屬(Polygonatum)、知母屬(Anemarrhena)等屬的多種植物在不同地區(qū)作為白及的混偽品使用[6-7]。“水白及”多為白及的近屬植物，其性狀特征與白及十分相似，容易造成混淆，運用紅外技術建立白及和“水白及”鑒別的方法具有一定是價值和意義。

常見的白及的傳統鑒定方法主要包括性狀鑒別、顯微鑒別和理化性質鑒別[8-10]，已有學者報道白及的DNA鑒別[11]、近紅外光譜[12]等，但尚未見紅外光譜結合化學計量數在白及和“水白及”鑒別中的研究。鑒于此，該研究對白及和“水白及”共37批樣品的紅外光譜進行自動基線校正、平滑，二階求導等處理，進一步進行系統聚類分析(HCA)、主成分分析(PCA)及正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)，快速鑒別白及和“水白及”，為白及的開發(fā)利用提供科學依據。

1 材料

1.1 儀器與試劑

傅里葉變換紅外光譜儀(Nicolet iN10 MX)、DTGS 檢測器、SMART ITR附件：美國Thermo Fisher Scientific 公司、高速多功能粉碎機：合肥億心程試驗設備有限公司；無水乙醇：國藥集團化學試劑有限公司；實驗所用試劑均為分析純。

1.2 樣品來源與制備

白及及“水白及”樣品主要來源于安徽、云南、四川、貴州、廣西、湖南等地，除少量自采以外，樣品多采購于藥材市場，詳細信息見表1。按照2020版《中國藥典》采收要求，將37批樣品，曬干，打粉，過80目篩備用，置4℃冰箱中保存。

表1 樣品信息

2 方法

2.1 數據采集

精密稱取1.2節(jié)中制備的白及、“水白及”樣品粉末，平攤于SMART ITR附件的金剛石上，旋轉附件旋鈕將樣品固定，壓成透明薄片。利用傅里葉變換紅外光譜儀，在4000～525cm-1范圍內采集紅外光譜，樣品壓片累積掃描16次，掃描速度為0.2 cm/s，間隔4cm-1，過程實時扣除H2O和CO2的干擾。

2.2 數據分析

采用OriginPro 2019軟件對白及和“水白及”共37批樣品的紅外光譜進行自動基線校正、平滑，并繪制紅外光譜圖，詳見圖1和圖2。再取樣品紅外光譜的平均圖譜作為紅外標準圖譜，并進行二階導數處理，得到相對應的二階導數紅外光譜圖，運用Origin軟件進行自動尋峰，導出數據，得到峰位、峰強等信息?；诩t外光譜數據，運用SPSS 26.0軟件進行系統聚類分析(HCA)，使用SIMCA 16.1軟件進行主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)。

圖1 19批白及的紅外光譜圖譜

圖2 18批“水白及”的紅外光譜圖譜

3 結果與分析

3.1 紅外光譜圖分析

從圖1中19批白及的紅外光譜圖譜可看出，白及樣品紅外光譜圖的峰形、峰位、峰高基本相似。如圖2所示，由于18批 “水白及”的來源不同，其紅外光譜圖在鋒形、峰位等方面存在一定的差異，粗略的可以分為3組，具體圖譜如圖3中B、C、D所示。19批白及藥材的紅外指紋圖譜相似(圖1所示)，主要吸收峰位于3366～3360、2977～2975、2932～2930、2894、2365～2362、2164、2025～2023、1976、1681～1679、1632、1587～1583、1526～1524、1450～1448、1386～1384、1326～1324、1268～1266、1226～1225、1147～1145、1087～1085、1050～1047、1007～1005、930～928、884、571～569cm-1等處。3363 cm-1附近強而寬的吸收峰為糖苷甾醇類、多糖、皂苷類化合物中O-H伸縮振動峰。2930 cm-1附近吸收峰為C-H伸縮振動峰；1679 cm-1處附近吸收峰表征為羰基C=O伸縮振動；1632 cm-1處附近吸收峰表征為N-H彎曲振動；1583、1525、1450 cm-1為苯環(huán)骨架C=C伸縮振動，可能為聯芐類、蒽醌類、菲類化合物的吸收峰；1324 cm-1附近吸收峰為C-0伸縮振動峰；1267 cm-1可能是C-O伸縮振動和C-H彎曲振動的疊加，多為糖苷類、脂類、多糖類中C=C骨架C=O-C伸縮振動；1147 cm-1附近吸收峰為-COOH彎曲振動；1048、1006、928 cm-1附近由多個吸收峰重疊成的寬強峰，為多糖、苷類等碳水化合物的C-O伸縮振動。[13-16]

18批“水白及”紅外指紋圖譜(如圖2所示)，從整體上看具有較高的相似，由于市場上的“水白及”具有多個不同來源，其紅外光譜圖在峰形、峰位等方面存在一定的差異，粗略的可以分為3組，具體圖譜如圖3中B(S1、S3、S5、S7、S11)、C(S2、S4、S17)、D(S6、S8、S9、S10、S12、S13、S14、S15、S16、S18)所示。白及和“水白及”在4000～1800 cm-1區(qū)紅外指紋圖譜吸收峰稀少，在吸收峰的個數、峰形、峰位等方面基本一致，共有8個共有吸收峰。白及和“水白及”在1800～800 cm-1區(qū)的紅外指紋圖譜吸收峰較為密集，除去在1453～1444、1387～1381、1332～1324、1091～1083、1051～1046、885～879 cm-1處的7個共有峰之外，白及在1679、1632、1583、1525、1267、1147、1106、928 cm-1處有明顯吸收峰；3組“水白及”中B組在1719、1642、1272 cm-1處有明顯吸收峰，C組1715、1280、803 cm-1處有明顯吸收峰，D組在1717、1652、1417、1270、930、815 cm-1處有明顯吸收峰。白及和“水白及”在1800～800 cm-1區(qū)的紅外指紋圖譜除了吸收峰的不同，在吸收峰的峰形和峰強等方面也存在明顯區(qū)別，所以紅外光譜可以作為白及和“水白及”的鑒別依據。

圖3 白及(A)和“水白及”(B～D)紅外光譜圖(4000～525cm-1)

3.2 二階導紅外光譜圖分析

二階導數光譜，可以提高光譜圖的分辨率，在一定程度上減少紅外光譜重疊峰的疊加，使吸收峰變得窄而尖。采用Origin進行二階導處理，選用Savitsky-Golay卷曲平滑法進行平滑處理，得到特征峰明顯的二階導數光譜圖；在紅外光譜圖中，1800 cm-1之前會受到-OH的影響，在800 cm-1之后基線的漂移過大，因此選擇1800～800 cm-1范圍，對白及和“水白及”二階導數光譜圖進行分析[17-18]。

從圖4可以看出，在1800～1300 cm-1范圍內，白及和“水白及”的二階導數光譜圖在峰數、峰位、峰形、峰強上均存在明顯的差異，可以用于鑒定。從圖5可以看出，白及和“水白及”的二階導數光譜圖在1300～800 cm-1范圍內，區(qū)域1中白及在1224、1200、1154 cm-1處峰明顯，“水白及”(B)在1240、1197、1154 cm-1處峰明顯，“水白及”(C)在1202、1168、1135 cm-1處峰明顯，“水白及”(D)在1199、1167、1128 cm-1處峰明顯，白及的峰強顯高于“水白及”(B、C、D)的峰強；在區(qū)域2中白及在998、930 cm-1處峰明顯，“水白及”(B)在993、941 cm-1處峰明顯，“水白及”(C)在982、935 cm-1處峰明顯，“水白及”(D)在1015、983、928 cm-1處峰明顯，白及和“水白及”(D)的峰強顯高于“水白及”(B、C)的峰強。

圖4 白及(A)和“水白及”(B～D)二階導數紅外光譜圖(1800～1300cm-1)

圖5 白及(A)和“水白及”(B～D)二階導數紅外光譜圖(1300～800cm-1)

3.3 系統聚類分析(HCA)

以37白及和“水白及”樣品的紅外光譜為原始數據，運用SPSS27.0軟件，采用組間聯接法以平方歐式距離為分類依據進行系統聚類分析，得到聚類分析結果見圖6；從圖中可知，當歐氏距離為5時，37批樣品被分為兩類，19批白及聚為一類，18批“水白及”聚為一類。HCA分析結果表明，白及與“水白及”之間存在明顯差異。

圖6 白及和“水白及”聚類分析圖

3.4 主成分分析(PCA)

主成分分析是一種有效的解釋復雜數據的工具，通過對復雜數據降維，將數據眾多變量的多元變量濃縮成少數主成分，前幾個主成分往往能夠在復雜的中藥體系中表征數據的總體信息，近年來，該方法在中藥評價和鑒別方面廣泛應用[19-21]。為更加客觀的分析白及和“水白及”的差異性，選取紅外光譜在 1800～800 cm-1內的數據，采用SIMCA 16.1軟件對白及和“水白及”共37個樣本進行主成分分析(PCA)，得到主成分分析得分圖(見圖7)，其中PC1和PC2的方差貢獻率分別為96.8%和2.72%，累計方差貢獻率達99.52%。模型解釋率參數R2X為0.992、預測能力參數為0.99，表征PCA模型的區(qū)分度和預測程度都較好。由圖7(A)可知，白及和“水白及”樣品分別分布在t[1]象限的負值區(qū)和正值區(qū)；如圖7(B)所示，各點的聚集狀態(tài)充分證明白及和“水白及”內在成分不同。由此可見，PCA對白及和其偽品“水白及”樣品具有較好的區(qū)分效果。

A

3.5 正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)

在無監(jiān)督PCA分析的基礎上，進行OPLS-DA分析(見圖8)，白及和“水白及”所處象限范圍與PCA分析結果一致，但組間的差異變大、組內的差異變小。由圖8可知，白及樣品分布在t[1]負值區(qū)域，“水白及”樣品分布于t[1]正值區(qū)域，白及和“水白及”樣品可以達到較好的區(qū)分效果。模型解釋率參數R2X、R2Y分別為0.999、0.992，預測能力參數Q2為0.983，R2、Q2的數值均高于0.5，說明模型穩(wěn)定性好，預測能力強[22-23]。如圖9所示，經過200次置換檢驗得到R2和Q2的Y軸截距分別為0.203和﹣0.59，說明模型驗證有效。

A

圖9 白及和“水白及”O(jiān)PLS-DA模型交叉驗證結果

4 討論

隨著白及藥材野生資源的枯竭，以及栽培技術的制約，近年來白及藥材的用量較大，價格居高不下，使得市場中出現多種混偽品。白及的混偽品主要來源于蘭科、百合科多種植物，其切片以后外形和白及較為相似，易與白及飲片造成混淆[7]。該研究運用紅外光譜，結合化學計量學分析軟件，探討白及和其偽品“水白及”的快速鑒別方法。

通過紅外光譜指紋圖譜研究發(fā)現，白及和“水白及”在1800～800 cm-1區(qū)域內存在明顯差異，除7共有峰之外，白及具有8處明顯吸收峰，3組“水白及”中B組具有3處有明顯吸收峰、C組具有3處有明顯吸收峰、D組具有6處有明顯吸收峰。從二階導數光譜圖中發(fā)現，白及和“水白及”在1800～800 cm-1峰位、峰形及峰強存在明顯差異，表明白及與“水白及”化學成分存在差異。

在運用HCA、PCA、OPLS-DA方法后能明顯鑒別白及和“水白及”。通過系統聚類分析(HCA)，當歐氏距離為5時，白及和“水白及”聚為兩類。PCA和OPLS-DA的分析結果一致，白及分布在t[1]象限負值區(qū)，“水白及”分布在t[1]象限正值區(qū)，其中OPLS-DA的分類結果最突出。該研究為白及和其偽品“水白及”的鑒別提供了快速、簡便的方法，也為白及的鑒別及質量評價提供了科學依據。