祁子麟

(湖北科技學(xué)院醫(yī)學(xué)部,湖北 咸寧 437100)

口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)是全球癌癥死亡的第六大原因,每年約560 000人發(fā)生并導(dǎo)致超過300 000人死亡[1]。手術(shù)、放療、化療或聯(lián)合治療對(duì)患者的生活質(zhì)量造成巨大影響,可能會(huì)出現(xiàn)語言障礙、吞咽困難和面部重塑等情況[2]。

穿心蓮內(nèi)酯(andrographolide,AG)是穿心蓮的主要成分,具有抗癌、抗炎、抗菌、抗HIV、抗動(dòng)脈粥樣硬化等作用[3-4]。有研究顯示,穿心蓮內(nèi)酯可以通過抑制p300信號(hào)通路和VEGF通路的失活阻止COX-2表達(dá)和血管生成,從而對(duì)乳腺癌起到治療作用[5];它也可以減少口腔癌干細(xì)胞的增殖和自我更新,抑制致癌性和增強(qiáng)放射敏感性[6]。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù),分析穿心蓮內(nèi)酯與口腔鱗狀細(xì)胞癌之間的關(guān)聯(lián),識(shí)別新的生物標(biāo)志物,以尋找潛在治療靶基因,為穿心蓮內(nèi)酯在口腔鱗狀細(xì)胞癌的臨床治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 篩選穿心蓮內(nèi)酯作用靶點(diǎn)

在Pubchem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中檢索“Andrographolide”得到穿心蓮內(nèi)酯的2D結(jié)構(gòu),并將它導(dǎo)入SwissTarget Prediction數(shù)據(jù)庫(http://www.swisstargetprediction.ch/)獲取其潛在治療靶點(diǎn)。

1.2 篩選OSCC相關(guān)靶點(diǎn)

在Genecards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)中檢索“OSCC”,找到與OSCC相關(guān)的靶點(diǎn)。使用Venny在線網(wǎng)站(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)獲得穿心蓮內(nèi)酯在OSCC中的相關(guān)靶點(diǎn)。

1.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

使用STRING數(shù)據(jù)庫(https://cn.string-db.org/)構(gòu)建藥物-疾病共同靶點(diǎn)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)圖,將共同靶基因?qū)搿?/p>

1.4 GO和KEGG通路分析

GO富集分析和KEGG通路分析DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)和KEGG(https://www.kegg.jp/)數(shù)據(jù)庫,找到共同靶基因存在的生物功能。

1.5 篩選關(guān)鍵基因

使用Cytoscape軟件的hubba插件得到共同靶基因中排名前十的關(guān)鍵基因,并構(gòu)建藥物—靶點(diǎn)—通路網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 分子對(duì)接

在RCSB PDB下載蛋白結(jié)構(gòu),Pubchem數(shù)據(jù)庫下載穿心蓮內(nèi)酯2D結(jié)構(gòu),使用Openbabel軟件將穿心蓮內(nèi)酯格式轉(zhuǎn)換為“PDB”格式,使用AutoDock Vina軟件進(jìn)行加氫、加電子等操作,并用來分子對(duì)接,結(jié)合能最小的對(duì)接模型為標(biāo)準(zhǔn),使用Pymol軟件繪制可視圖。

2 結(jié) 果

2.1 穿心蓮內(nèi)酯作用靶點(diǎn)

在Pubchem上獲得穿心蓮內(nèi)酯的2D結(jié)構(gòu)(圖1),共獲得100個(gè)穿心蓮內(nèi)酯的潛在作用靶點(diǎn)。

圖1 穿心蓮內(nèi)酯2D結(jié)構(gòu)圖

2.2 穿心蓮內(nèi)酯與OSCC共同靶點(diǎn)的篩選

在Genecards數(shù)據(jù)中檢索到OSCC有1990個(gè)靶點(diǎn)。在Venny網(wǎng)站上繪制韋恩圖,得到31個(gè)共同靶點(diǎn)(圖2)。

圖2 穿心蓮內(nèi)酯與OSCC共同靶點(diǎn)

2.3 共同靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

將共同靶基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。Cytoscape軟件可以直觀分析共同靶基因之間的復(fù)雜關(guān)系(圖3)。

圖3 穿心蓮內(nèi)酯與OSCC共同靶基因PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 GO富集和KEGG通路分析

31個(gè)共同靶點(diǎn)GO富集顯示,主要生物過程為蛋白磷酸化、磷酸化、含磷化合物代謝過程、細(xì)胞連接的正調(diào)節(jié)等(圖4),主要細(xì)胞組分為細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶全酶復(fù)合物、胞質(zhì)溶膠、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶復(fù)合物等(圖5),分子功能主要為蛋白激酶活性、磷酸轉(zhuǎn)移酶活性、激酶活性等(圖6)。

圖4 共同靶基因的主要生物過程(BP) 圖5 共同靶基因的主要細(xì)胞成分(CC)

圖6 共同靶基因的分子功能(MF) 圖7 共同靶基因的主要信號(hào)通路

31個(gè)共同靶點(diǎn)KEGG通路顯示,這些靶點(diǎn)主要富集在PI3K-Akt信號(hào)通路、RIG-I樣受體信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、癌癥通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥、AGE-RAGE信號(hào)通路在糖尿病并發(fā)癥中的作用等(圖7)。

2.5 關(guān)鍵基因的篩選

將PPI網(wǎng)絡(luò)圖導(dǎo)入Cytoscape軟件中,使用hubba插件獲得排名前十的基因,分別為GSK3β、JAK2、KDR、MAPK1、MMP9、CDK4、CDK2、IL6、AR、CDK6。藥物-靶點(diǎn)-通路圖如圖8。

圖8 藥物-靶點(diǎn)-通路圖

2.6 穿心蓮內(nèi)酯與關(guān)鍵靶蛋白GSK3β和JAK2的分子對(duì)接

使用穿心蓮內(nèi)酯與GSK3β和JAK2分子進(jìn)行分子對(duì)接。結(jié)果顯示,穿心蓮內(nèi)酯與GSK3β 分子對(duì)接結(jié)合能為-9.00kcal/mol(圖9),與JAK2分子對(duì)接結(jié)合能為-8.5kcal/mol(圖10),結(jié)合能均為負(fù)值,充分表示穿心蓮內(nèi)酯和GSK3β、JAK2分子自發(fā)結(jié)合。通常與受體結(jié)合能越低,結(jié)合的構(gòu)象越穩(wěn)定。

圖9 穿心蓮內(nèi)酯與關(guān)鍵靶蛋白GSK3β的分子對(duì)接 圖10 穿心蓮內(nèi)酯與關(guān)鍵靶蛋白JAK2的分子對(duì)接

3 討 論

有研究表明[7],100μmol/L濃度的穿心蓮內(nèi)酯對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞有顯著的抑制作用,并能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。也有研究表示[8],穿心蓮內(nèi)酯是用于治療口腔癌的潛在化合物。雖然很多研究都可以證明穿心蓮內(nèi)酯對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌有治療作用,但是其潛在的分子機(jī)制尚不明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是識(shí)別草藥替代靶點(diǎn)的有力工具,在促進(jìn)新藥開發(fā)和評(píng)估其安全性方面具有優(yōu)勢[9-10]。因此,我們運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析穿心蓮內(nèi)酯與口腔鱗狀細(xì)胞癌之間的關(guān)聯(lián),探索兩者之間潛在的分子機(jī)制。

本研究分別找到穿心蓮內(nèi)酯和口腔鱗狀細(xì)胞癌的潛在作用靶點(diǎn),通過韋恩圖交集后得到31個(gè)共同靶點(diǎn),最后PPI網(wǎng)絡(luò)圖篩選出穿心蓮內(nèi)酯作用于口腔鱗狀細(xì)胞癌排名前十的重要樞紐基因,分別為GSK3β、JAK2、KDR、MAPK1、MMP9、CDK4、CDK2、IL6、AR、CDK6。GSK3β是糖原合酶激酶3β,它可以通過下調(diào)GSK3β的表達(dá)從而抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌的細(xì)胞增殖[11]。也有研究證實(shí)[12],GSK3β與口腔鱗狀細(xì)胞癌密切相關(guān),在活檢中高度表達(dá)。JAK2是酪氨酸蛋白激酶,甘草查耳酮H可以通過調(diào)控JAK2從而抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌的細(xì)胞生長,并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13]。KDR是血管內(nèi)皮生長因子受體,實(shí)驗(yàn)中檢測到口腔鱗狀細(xì)胞癌的特異性為100%,敏感性為70%,因此,它可以作為早期檢測口腔鱗狀細(xì)胞癌的生物標(biāo)志物[14]。MMP9是基質(zhì)金屬蛋白酶,當(dāng)在口腔鱗癌的組織學(xué)陰性手術(shù)切緣中檢測到MMP9時(shí),它可作為腫瘤復(fù)發(fā)的預(yù)測因子[15]。也有數(shù)據(jù)表明[16]MMP9通過調(diào)節(jié)其親本基因的信使RNA穩(wěn)定,在口腔鱗狀細(xì)胞癌中起到促進(jìn)轉(zhuǎn)移基因的作用。IL6是白細(xì)胞介素,IL6抗體治療在體外和體內(nèi)動(dòng)物模型中完全抑制了口腔癌細(xì)胞的骨侵襲[17],并且增加口腔和口咽癌患者的血清和唾液中IL6表達(dá)[18-20]。以上研究結(jié)果表明,上述基因可能是穿心蓮內(nèi)酯治療口腔鱗狀細(xì)胞癌的潛在作用靶點(diǎn)。

通過對(duì)穿心蓮內(nèi)酯和口腔鱗狀細(xì)胞癌的31個(gè)共同靶基因的KEGG通路分析結(jié)果顯示,共同靶基因主要與PI3K-Akt信號(hào)通路、RIG-I樣受體信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、癌癥通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥、AGE-RAGE信號(hào)通路在糖尿病并發(fā)癥中的作用等有關(guān)。研究顯示[21],敲除SPP1基因通過PI3K-Akt信號(hào)通路可以促進(jìn)OSCC細(xì)胞凋亡,且EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥與順鉑的獲得性耐藥有很大的關(guān)系,從而促進(jìn)OSCC細(xì)胞的凋亡。RIG-I樣受體信號(hào)通路已被驗(yàn)證在白斑到OSCC的過程中也會(huì)發(fā)生作用[22]。這些研究也證實(shí)了我們KEGG通路富集的結(jié)果。

最后從十個(gè)關(guān)鍵靶基因GSK3β、JAK2、KDR、MAPK1、MMP9、CDK4、CDK2、IL6、AR、CDK6中篩選出兩個(gè)基因,即GSK3β和JAK2。讓穿心蓮內(nèi)酯與關(guān)鍵靶點(diǎn)GSK3β和JAK2進(jìn)行分子對(duì)接,結(jié)果顯示,穿心蓮內(nèi)酯與相對(duì)應(yīng)的作用靶點(diǎn)GSK3β和JAK2均有較好的親和力和結(jié)合力,從而驗(yàn)證了本研究預(yù)測的準(zhǔn)確性,說明了這些基因是穿心蓮內(nèi)酯治療口腔鱗狀細(xì)胞癌的作用關(guān)鍵點(diǎn)。

綜上所述,本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué),通過對(duì)穿心蓮內(nèi)酯抗口腔鱗狀細(xì)胞癌作用靶點(diǎn)的GO富集和KEGG通路分析,篩選關(guān)鍵靶基因,以及用穿心蓮內(nèi)酯與關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接,明確了穿心蓮內(nèi)酯治療口腔鱗狀細(xì)胞癌的分子機(jī)制,為穿心蓮內(nèi)酯擴(kuò)寬了藥用價(jià)值,也為口腔鱗癌細(xì)胞的治療提供了新的研究思路。