付時(shí)琛,吳 娜,譚 潔,羅斌華,任 平

(1.湖北科技學(xué)院醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院,湖北 咸寧 437100;2.武漢輕工大學(xué)醫(yī)學(xué)與健康學(xué)院)

轉(zhuǎn)移性癌癥誘發(fā)的骨痛是一種慢性疼痛,具有獨(dú)特而復(fù)雜的病理生理學(xué)特征。世衛(wèi)組織指南推薦使用非阿片類藥物-弱阿片類藥物-強(qiáng)效阿片類藥物的階梯式方法來緩解疼痛[1],但效果有限或副作用難以忍受。如何有效緩解患者的疼痛仍然是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn),因此,積極探索骨癌痛發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制,尋找新的有效低毒藥物有著重要的現(xiàn)實(shí)意義。大黃素(3-甲基-1,6,8-trihydroxyanthraquinone)分離自天然存在的蒽醌衍生物大黃,具有抗感受傷害、抗炎、抗微生物生長(zhǎng)、免疫抑制、抗腫瘤等作用[2-3]。有報(bào)道稱,大黃素可以通過抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥過程來減輕疼痛[4]。但是大黃素是否對(duì)骨轉(zhuǎn)移性疼痛大鼠起作用尚未有報(bào)道。因此,本研究在構(gòu)建骨癌痛模型的基礎(chǔ)上,探討大黃素對(duì)骨癌痛大鼠的鎮(zhèn)痛效應(yīng)及其可能的作用機(jī)制,為骨癌痛新藥的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要藥品與試劑

RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、DMSO溶液和胰蛋白酶(美國(guó)Gibco公司);大黃素,純度≥98%(Aladdin);GFAP抗體(ABclonal)。

1.2 主要儀器

Von Frey纖維絲痛閾測(cè)試包(美國(guó)stoelting公司);多功能酶標(biāo)儀(Bio Tek);二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱(德國(guó)Binder公司);電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。

1.3 細(xì)胞

MRMT-1大鼠乳腺癌細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清和100U/mL青霉素及100U/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中,置于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雌性SD大鼠,體質(zhì)量180～200g,購(gòu)自湖北貝恩特生物科技有限公司,許可證號(hào):SCXK(鄂)2021-0027,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)塑料飼養(yǎng)籠中,室溫22℃～25℃,飼養(yǎng)環(huán)境通風(fēng),自由攝食飲水,保證12h/12h正常節(jié)律。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 大鼠骨癌痛模型的建立

大鼠骨癌痛模型的建立采用經(jīng)典方法[5],大鼠10%水合氯醛(3mL/kg)麻醉后,仰臥固定于鼠臺(tái)上,左后肢脫毛,暴露脛骨骨面,1mL注射器在骨面上打孔,后換用10μL微量注射器,在脛骨骨髓腔中緩慢注入10μL MRMT-1大鼠乳腺癌細(xì)胞(約3×105個(gè)),假手術(shù)組大鼠脛骨注射等體積生理鹽水,無菌骨蠟封住針孔,75%酒精消滅溢出的腫瘤細(xì)胞,逐層縫合皮膚,消毒后涂抹青霉素粉末預(yù)防感染。術(shù)前、術(shù)后第3、6、9、12、14d檢測(cè)并記錄大鼠的機(jī)械縮足反射閾值。

1.5.2 大黃素納米乳的制備

采用超聲乳化法制備大黃素納米乳。精確稱取大黃素10mg,加入0.4mL大豆油,再加入0.4mL吐溫80和0.2mL甘油,超聲10min使其混合均勻。將裝有3mL蒸餾水的燒杯置于細(xì)胞超聲破碎儀探頭下,設(shè)定功率為30%(195W)、工作時(shí)間5min。在超聲的過程中,含藥溶液用膠頭滴管逐滴滴加到水相中,形成大黃素納米乳。

1.5.3 分組與給藥

將SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和大黃素組,每組6只。術(shù)后14d行為學(xué)測(cè)定結(jié)束后,大黃素組單次鞘內(nèi)注射大黃素納米乳(5mg/mL),每只10μL,大鼠出現(xiàn)甩尾行為表明注射成功,假手術(shù)組和模型組分別鞘內(nèi)注射等體積生理鹽水。注射后0、1、2、3、4h檢測(cè)行為學(xué)變化。

1.5.4 檢測(cè)各組大鼠脛骨病理學(xué)改變

術(shù)后第14d,取假手術(shù)組和模型組大鼠,10%水合氯醛麻醉后仰臥位固定,X光機(jī)拍攝各組大鼠脛骨X線片,觀察脛骨病理學(xué)改變。

1.5.5 觀察各組大鼠骨組織病理學(xué)變化情況

術(shù)后14d最后一次行為學(xué)檢測(cè)結(jié)束后,取假手術(shù)組和模型組大鼠術(shù)側(cè)脛骨標(biāo)本,4%多聚甲醛溶液固定過夜,10%EDTA溶液脫鈣21d后,石蠟包埋、切片進(jìn)行HE染色。光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理學(xué)變化情況。

1.5.6 大鼠機(jī)械痛行為檢測(cè)

測(cè)定前將各組大鼠置于四周透明、底部鏤空的有機(jī)玻璃盒中30min使之適應(yīng),采用Up and Down法[6],用Von Frey纖維絲自上而下刺激各組大鼠左后足足趾底部中心,觀察大鼠縮足反應(yīng),記錄此時(shí)對(duì)應(yīng)的折力值(g),即機(jī)械縮足反射閾值。實(shí)驗(yàn)需同一人操作,保證刺激強(qiáng)度一致,每只大鼠重復(fù)3次,取平均值。

1.5.7 檢測(cè)大鼠脊髓GFAP的表達(dá)分布

處死大鼠后,取大鼠L4-L6損傷側(cè)脊髓,4%多聚甲醛灌注后,進(jìn)行冰凍切片,充分漂洗。加入GFAP(1∶500)一抗,室溫孵育1h,4℃過夜;第2d漂洗后,加入對(duì)應(yīng)熒光二抗,避光孵育2h,封片,熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.5.8 檢測(cè)大鼠脊髓GFAP蛋白表達(dá)

最后一次行為學(xué)測(cè)定結(jié)束后,麻醉處死各組大鼠,冰上取大鼠L4-L6損傷側(cè)脊髓,加入裂解液,勻漿后提取總蛋白,BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量,進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜封閉后,加入GFAP、GAPDH抗體,4℃孵育過夜,TBST洗滌3次,每次10min,加入二抗室溫孵育1h,TBST洗滌3次,每次10min。對(duì)應(yīng)條帶加入ECL化學(xué)發(fā)光液,曝光成像,GAPDH為內(nèi)參,Image J軟件對(duì)條帶進(jìn)行分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 大鼠骨癌痛模型的鑒定

X線片顯示,與假手術(shù)組大鼠相比,模型組大鼠脛骨可見明顯的骨質(zhì)破壞,骨密度不均勻,組織周圍出現(xiàn)明顯腫脹。HE染色顯示,與假手術(shù)組相比,模型組大鼠脛骨骨小梁及骨髓腔內(nèi)充滿腫瘤細(xì)胞,出現(xiàn)骨質(zhì)破壞,提示骨癌痛模型建立成功。見圖1。

A:假手術(shù)組X線影像;B:模型組X線影像;C:假手術(shù)組HE染色;D:模型組HE染色圖1 假手術(shù)組和模型組大鼠脛骨X線影像和HE染色結(jié)果(HE×100)

2.2 大鼠機(jī)械縮足反射閾值的檢測(cè)結(jié)果

各組大鼠術(shù)前機(jī)械縮足閾值(PWT)無明顯差異(P<0.05);造模后7～14d,與假手術(shù)組相比,模型組和大黃素組大鼠PWT值均顯著降低(P<0.05)。見表1。在大黃素納米乳治療前,模型組與大黃素組PWT值無明顯差異(P>0.05),在治療后的1、2、3h,大黃素組的PWT值均顯著升高(P<0.05),4h降低至接近注射前水平。見表2。

表1 各組大鼠造模后0-14d術(shù)側(cè)后爪PWT值比較

表2 納米大黃素治療后各組大鼠術(shù)側(cè)后爪PWT值比較

2.3 大鼠脊髓背角神經(jīng)元活動(dòng)的結(jié)果

采用免疫熒光檢測(cè)各組大鼠L4-L6腰段脊髓中GFAP表達(dá)情況,如圖2顯示,與假手術(shù)組相比,模型組大鼠脊髓中GFAP的表達(dá)明顯增強(qiáng);與模型組相比,大黃素組大鼠脊髓中GFAP的表達(dá)量顯著下降,提示鞘內(nèi)注射大黃素納米乳可以顯著抑制骨癌痛大鼠脊髓背角GFAP的表達(dá)。

圖2 鞘內(nèi)注射大黃素納米乳對(duì)骨癌痛大鼠脊髓背角GFAP(紅色)表達(dá)的影響(n=3,標(biāo)尺=100μm)

2.4 大黃素納米乳對(duì)大鼠脊髓中GFAP蛋白表達(dá)的影響

與假手術(shù)組相比,模型組大鼠脊髓中GFAP蛋白表達(dá)量明顯增加(P<0.01);與模型組比較,大黃素組大鼠脊髓中GFAP蛋白表達(dá)量明顯降低(P<0.01)。見圖3。

與假手術(shù)組比較,*P<0.01;與模型組比較,#P<0.01,n=3圖3 鞘內(nèi)注射大黃素納米乳對(duì)骨癌痛大鼠脊髓中GFAP蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

骨骼系統(tǒng)是癌癥轉(zhuǎn)移的第三大常見部位,僅次于肺和肝,許多腫瘤,尤其是乳腺、前列腺、肺和腎的腫瘤都有很強(qiáng)的骨轉(zhuǎn)移傾向。據(jù)統(tǒng)計(jì),70%的患者在疾病診斷時(shí)會(huì)發(fā)生骨病理改變,這會(huì)導(dǎo)致疼痛、高血鈣癥、病理性骨折、脊髓或其他神經(jīng)結(jié)構(gòu)受到壓迫、活動(dòng)能力下降,從而增加死亡率[7]。中藥對(duì)急性或慢性疼痛均能起到一定的鎮(zhèn)痛作用,其低成癮性和較少的副作用有望成為新的鎮(zhèn)痛選擇。因此,探究骨癌痛的作用機(jī)制,尋找高效安全的藥物改善患者生活質(zhì)量是很有必要的[8]。本研究通過在大鼠脛骨骨髓腔中注入MRMT-1大鼠乳腺癌細(xì)胞,結(jié)果顯示,模型組大鼠機(jī)械痛閾值較假手術(shù)組明顯降低,且HE染色發(fā)現(xiàn)脛骨發(fā)生癌細(xì)胞浸潤(rùn),提示骨癌痛模型建模成功。進(jìn)一步注射大黃素納米乳發(fā)現(xiàn),大黃素組大鼠機(jī)械痛閾值在一定時(shí)間內(nèi)明顯升高,幾小時(shí)后痛閾值降低至初始疼痛水平,大黃素完全耐受,說明大黃素納米乳可以短期改善大鼠骨癌痛。

神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞簡(jiǎn)稱膠質(zhì)細(xì)胞,是神經(jīng)組織中除神經(jīng)元以外的另一大類細(xì)胞,在神經(jīng)免疫、神經(jīng)元信號(hào)傳遞的調(diào)控等方面起著不可或缺的作用,與中樞敏化的產(chǎn)生和疼痛密切相關(guān)[9]。在脊髓水平上,激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)釋放多種促炎因子,例如TNF-α、IL-1β、TGF等,這些促炎細(xì)胞因子會(huì)導(dǎo)致更多神經(jīng)遞質(zhì)的釋放,從而促進(jìn)疼痛信號(hào)在中樞的傳遞,激活疼痛[10]。在骨癌痛等慢性疼痛中,TNF-α、IL-1β水平升高。膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)是星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的標(biāo)志物[11],GFAP表達(dá)的增加,引起轉(zhuǎn)錄后修飾,導(dǎo)致脊髓促炎物質(zhì)增加神經(jīng)的興奮性,加重疼痛反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示,模型組大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記蛋白GFAP表達(dá)上調(diào),給予大黃素納米乳治療后,GFAP的表達(dá)明顯被抑制,這表明大黃素納米乳可能通過抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活,從而緩解大鼠骨癌痛,為骨癌痛新藥的開發(fā)提供理論依據(jù)。