韋華琴,李 燕,解曉敏,梁 瀟,武 陽(yáng),楊 旭,孫燕玲,馬 萍**,馬夢(mèng)君

(1.湖北科技學(xué)院醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院,湖北 咸寧 437100;2.湖北科技學(xué)院醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院咸寧市健康環(huán)境工程技術(shù)研究中心;3.湖北省智慧康養(yǎng)產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院;4.咸寧市農(nóng)業(yè)科學(xué)院)

近幾年,在茶葉成分的生化研究中,沒食子酸(gallic acid,GA)作為黑茶中的特征性酚類物質(zhì)受到關(guān)注[1]。有研究表明,湖北青磚茶中GA的含量較高,且隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng),GA的含量逐年增高[2]。作為一種有機(jī)酸類化合物,GA很容易被吸收,特別是對(duì)人體的重要臟器有較強(qiáng)的親和力,同時(shí)有非常廣的作用范圍,其藥理作用多樣,主要用于抗腫瘤、抗?jié)?、抗過(guò)敏和抗病毒等[3-4]。

線粒體是細(xì)胞的能量工廠,也是生產(chǎn)車間。線粒體功能的正常是細(xì)胞進(jìn)行有序代謝活動(dòng)的基礎(chǔ),也是機(jī)體進(jìn)行正常生命活動(dòng)的前提。You等[5]發(fā)現(xiàn)GA可以顯著增加人宮頸癌HeLa細(xì)胞內(nèi)的活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平,抑制細(xì)胞的增殖;吳昊等[6]實(shí)驗(yàn)也表明,GA可通過(guò)提高ROS水平并上調(diào)促凋亡蛋白caspase-3、caspase-9、Bax的表達(dá)等方式促使細(xì)胞凋亡。本研究經(jīng)MTT、CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)GA對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞、胃癌SGC7901細(xì)胞、結(jié)腸癌EC109細(xì)胞生長(zhǎng)情況、ROS水平以及HepG2細(xì)胞膜電位的變化、HepG2細(xì)胞凋亡水平的影響,探討GA對(duì)癌細(xì)胞的作用及機(jī)制,為青磚茶的保健作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

主要儀器:酶標(biāo)儀(elx800,美國(guó)bio-TEK);多功能熒光酶標(biāo)儀(Hide Chameleon V,芬蘭Hidex);顯微鏡(dp73,日本奧林巴斯)。

主要試劑:DMEM、1640、FBS、胰酶、雙抗(美國(guó)GIBCO);GA、CCK-8(上海源葉生物科技有限公司);N-乙酰半胱氨酸(NAC)、線粒體膜電位與細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、Hoechst 33258(碧云天生物科技有限公司);噻唑藍(lán)(MTT)(南京建成生物工程研究所);ROS試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司,S0033);其余試劑均為實(shí)驗(yàn)室常用分析純。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及處理

肝癌細(xì)胞HepG2、胃癌細(xì)胞SGC7901、結(jié)腸癌細(xì)胞EC109購(gòu)自武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)保存中心(武漢CCTCC)。立刻放入37℃水浴鍋解凍,直至細(xì)胞凍存液完全溶解,轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi),加入約1mL培養(yǎng)液,用吸管輕輕吹打混勻,在1000r/min離心2min,棄上清,再加入適量培養(yǎng)液,輕輕吹打混勻,轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中,置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱。24h后觀察細(xì)胞貼壁情況,待細(xì)胞長(zhǎng)到80%～90%后傳代,吸除或倒掉細(xì)胞瓶?jī)?nèi)舊培養(yǎng)液,加少量PBS潤(rùn)洗細(xì)胞,加入1mL胰酶37℃孵育2min,然后加入2mL完全培養(yǎng)基終止消化,用吸管小心吹打貼壁的細(xì)胞,制成細(xì)胞懸液。在1000r/min離心2min,棄去上清,用3mL完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,按照1∶3的比例傳代,放入37℃含有5% CO2的潮濕培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.3 藥物配置

(1)2mg/mL GA母液:稱取20mg GA(純度>98%),加入10mL無(wú)水乙醇溶解,濾過(guò)器(0.22μm)過(guò)濾除菌,分裝4℃保存。后續(xù)實(shí)驗(yàn)將母液以完全培養(yǎng)基稀釋成所需濃度。

(2)500mmol/L抗氧化劑NAC(N-乙酰半胱氨酸)原液配制:用24mL PBS稀釋2g NAC,充分溶解后用濾過(guò)器(0.22μm)過(guò)濾作為原液,分裝-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 檢測(cè)方法

1.4.1 MTT法檢測(cè)

取生長(zhǎng)良好的3種癌細(xì)胞用含10%FBS的培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù)并分組,每組6個(gè)復(fù)孔,每孔2×104個(gè)細(xì)胞,200μL培基,接種到96孔板,在5% CO2、37℃的潮濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后給藥,再繼續(xù)培養(yǎng)24h后,吸棄培養(yǎng)基,每孔加入200μL含10%MTT溶液(PBS配終濃度5mg/mL)培養(yǎng)基,繼續(xù)孵育4h。吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清,每孔加入200μL DMSO振蕩10min后檢測(cè)。

1.4.2 CCK-8法檢測(cè)

取生長(zhǎng)良好的3種癌細(xì)胞用含10%FBS的培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù)并分組,每組6個(gè)復(fù)孔,每孔2×104個(gè)細(xì)胞,200μL培基,接種到96孔板,在5% CO2、37℃的潮濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后給藥,繼續(xù)培養(yǎng)24h后,棄掉培養(yǎng)基,每孔加200μL含10%CCK-8溶液的培養(yǎng)基,繼續(xù)孵育3h后在450nm檢測(cè)。

1.4.3 ROS測(cè)定

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的3種癌細(xì)胞,用含10%FBS的培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù)并分組,每組6個(gè)復(fù)孔,每孔4×104個(gè)細(xì)胞,200μL培養(yǎng)基接種到96孔板,在5% CO2、37℃的潮濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后處理。用含10%FBS培養(yǎng)液按照1∶1000稀釋DCFH-DA,使終濃度為10μmol/L。棄掉培養(yǎng)液,每孔加入200μL稀釋好的DCFH-DA。陽(yáng)性對(duì)照組按照1∶1000的比例使用。先裝載探針,再每孔加入1μL的陽(yáng)性對(duì)照刺激。使用488nm激發(fā)波長(zhǎng),525nm發(fā)射波長(zhǎng),在熒光酶標(biāo)儀上測(cè)定0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24h時(shí)各孔光吸收值。

1.4.4 Hoechst 33258熒光染色法

取潔凈蓋玻片置于六孔板內(nèi),取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HepG2細(xì)胞,用含10%FBS的培養(yǎng)液配成細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù)并分組,每孔3×105個(gè)細(xì)胞,2mL培基,接種到6孔板中,在5% CO2、37℃的潮濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后給藥。刺激細(xì)胞發(fā)生凋亡6h后,吸去培養(yǎng)液,每孔加入0.5mL固定液,固定10min后用PBS洗兩遍,每次3min,加入0.5mL Hoechst 33258染色液,染色5min后再用PBS洗兩遍,每次3min,用抗熒光淬滅封片液封片。

1.4.5 線粒體膜電位與細(xì)胞凋亡檢測(cè)

取潔凈蓋玻片置于六孔板內(nèi),取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HepG2細(xì)胞用含10%FBS的培養(yǎng)液配成細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù)并分組,每孔3×105個(gè)細(xì)胞,2mL培基,接種到6孔板,在5% CO2、37℃的潮濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后給藥。藥物刺激細(xì)胞12h后,棄去培養(yǎng)液,用PBS洗滌一次,加入188μL Annexin V-FITC結(jié)合液。加入5μL Annexin V-FITC,輕輕混勻。加入2μL Mito-Tracker Red CMXRos染色液和5μL Hoechst 33342染色液,輕輕混勻。室溫避光孵育20～30min,隨后置于冰浴中。隨即在熒光顯微鏡下觀察,Mito-Tracker Red CMXRos為紅色熒光,Annexin V-FITC為綠色熒光,Hoechst 33342為藍(lán)色熒光。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

利用Graphpad prism 9.0軟件建立實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)圖。經(jīng)方差分析(Analysis of Variance)和LSDt檢驗(yàn),P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié) 果

2.1 GA對(duì)HepG2、SGC7901和EC109細(xì)胞增殖的影響

如圖1A-B可以看出,當(dāng)GA濃度≥10μg/mL時(shí),對(duì)HepG2細(xì)胞的存活率和活性具有明顯的抑制作用,且隨著GA濃度的升高,抑制作用增強(qiáng);除在2μg/mL濃度下與Control組相比沒有顯著性差異外,其他濃度作用下,GA對(duì)HepG2細(xì)胞抑制作用顯著增強(qiáng)(P<0.01)。GA對(duì)HepG2細(xì)胞50%抑制濃度為:10μg/mL

A,C,E:HepG2細(xì)胞、SGC7901細(xì)胞、EC109細(xì)胞MTT檢測(cè)結(jié)果;B,D,F:HepG2細(xì)胞、SGC7901細(xì)胞、EC109細(xì)胞CCK-8檢測(cè)結(jié)果(與對(duì)照組比較,*P<0.05,**P<0.01)圖1 GA對(duì)HepG2細(xì)胞、SGC790細(xì)胞、EC109細(xì)胞增殖的影響

如圖1C-D所示,當(dāng)GA濃度≥10μg/mL時(shí),對(duì)SGC790細(xì)胞的存活率和活性具有明顯的抑制作用,且隨著GA濃度的升高,抑制作用增強(qiáng);除在5μg/mL濃度下與Control組相比沒有顯著性差異外,其他濃度作用下,GA對(duì)SGC790細(xì)胞抑制作用顯著增強(qiáng)(P<0.01)。GA對(duì)SGC7901細(xì)胞50%抑制濃度為:20μg/mL

如圖1E-F所示,GA對(duì)EC109細(xì)胞的存活率和活性具有顯著的抑制作用,且隨著GA濃度的升高,抑制作用增強(qiáng)(P<0.01)。MTT結(jié)果顯示,GA對(duì)EC109細(xì)胞50%抑制濃度為:50μg/mL

結(jié)果清楚地表明,隨著濃度的增加,GA對(duì)肝癌HepG2、胃癌SGC7901、結(jié)腸癌EC109三種細(xì)胞增殖的抑制作用都逐漸增強(qiáng),并且具有劑量依賴性(P<0.01)。

2.2 在NAC作用下,GA對(duì)HepG2、SGC7901和EC109細(xì)胞增殖的影響

N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)是氨基酸左旋半胱氨酸的代謝物,目前作為抗氧化劑的生物保護(hù)劑被廣泛研究[7]。

如圖2A-B所示,與Control組相比,10μg/mL GA組與25μg/mL GA組明顯抑制HepG2細(xì)胞的增殖。MTT結(jié)果顯示,25μg/mL GA+NAC組與25μg/mL GA組相比,細(xì)胞存活率顯著增高(P<0.01),10μg/mL GA+NAC組與10μg/mL GA組相比,細(xì)胞存活率也有所增高,但沒有顯著性差異。CCK-8結(jié)果顯示,與10μg/mL GA組和25μg/mL GA組相比,10μg/mL GA+NAC組與25μg/mL GA+NAC組細(xì)胞活性顯著增高(P<0.01)。

A,C,E:HepG2細(xì)胞、SGC7901細(xì)胞、EC109細(xì)胞MTT檢測(cè)結(jié)果,B,D,F:HepG2細(xì)胞、SGC7901細(xì)胞、EC109細(xì)胞CCK-8檢測(cè)結(jié)果(與Control組相比,*P<0.05,**P<0.01;與低濃度GA組相比,△P<0.05,△△P<0.01;與高濃度GA組相比,#P<0.05,##P<0.01)圖2 HepG2細(xì)胞、SGC7901細(xì)胞、EC109細(xì)胞生存率的變化

如圖2C-D所示,與Control組相比,20μg/mL GA組與30μg/mL GA組明顯抑制SGC7901細(xì)胞的增殖。MTT結(jié)果顯示,與20μg/mL GA組和30μg/mL GA組相比,20μg/mL GA+NAC組與30μg/mL GA+NAC組細(xì)胞存活率顯著增多(P<0.01)。CCK-8結(jié)果顯示,與20μg/mL GA組和30μg/mL GA組相比,20μg/mL GA+NAC組與30μg/mL GA+NAC組細(xì)胞活性顯著增高(P<0.05,P<0.01)。

如圖2E-F所示,與Control組相比,50μg/mL GA組與75μg/mL GA組EC109細(xì)胞活性與細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.01)。MTT結(jié)果顯示,與50μg/mL GA組和75μg/mL GA組相比,50μg/mL GA+NAC組與75μg/mL GA+NAC組細(xì)胞存活率顯著提高(P<0.01)。CCK-8結(jié)果顯示,與50μg/mL GA組和75μg/mL GA組相比,50μg/mL GA+NAC組與75μg/mL GA+NAC組細(xì)胞活性顯著增高(P<0.05)。

2.3 細(xì)胞內(nèi)的ROS水平

如圖3所示,三種癌細(xì)胞內(nèi)的ROS水平檢測(cè)結(jié)果一致,與Control組相比,在加入不同濃度GA 0.5～16h后三種癌細(xì)胞的ROS水平均明顯升高;與單純GA組相比,在相同濃度的GA+NAC組三種細(xì)胞內(nèi)ROS水平均顯著降低。檢測(cè)結(jié)果表明,與Control組相比,不同濃度的GA均能提高肝癌HepG2、胃癌SGC7901、結(jié)腸癌EC109三種細(xì)胞中ROS水平,而NAC可以阻斷這種促進(jìn)作用。

A:HepG2細(xì)胞;B:SGC7901細(xì)胞;C:EC109細(xì)胞圖3 細(xì)胞內(nèi)ROS水平的變化情況

2.4 HepG2細(xì)胞的熒光染色

Hoechst 33258為非嵌入性熒光染料,它們?cè)诨罴?xì)胞中與DNA結(jié)合,是針對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色的染料,可以反映細(xì)胞的凋亡情況。在熒光顯微鏡紫外光激發(fā)時(shí),Hoechst-DNA發(fā)出亮藍(lán)色熒光,常用于細(xì)胞凋亡檢測(cè)。HepG2細(xì)胞的熒光染色結(jié)果如圖4所示,與Control組相比,10μg/mL GA組和25μg/mL GA組HepG2細(xì)胞凋亡明顯增多,25μg/mL GA組比10μg/mL GA組HepG2細(xì)胞凋亡明顯增多,說(shuō)明GA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡且具有濃度依賴性。與GA組相比,10μg/mL GA+NAC組與25μg/mL GA+NAC組的細(xì)胞凋亡情況有所改善。

A:Control組;B:10μg/mL GA組;C:25μg/mL GA組;D:10μg/mL GA+NAC組;E:25μg/mL GA+NAC組圖4 HepG2細(xì)胞Hoechst 33258熒光染色

2.5 HepG2細(xì)胞線粒體膜電位、細(xì)胞凋亡

熒光染色的藍(lán)色熒光為Hoechst 33342對(duì)活細(xì)胞細(xì)胞核的染色,綠色熒光標(biāo)記的是發(fā)生了凋亡或壞死的細(xì)胞,紅色熒光標(biāo)記的是保持線粒體膜電位的活細(xì)胞。如圖5所示,與Control組相比,10μg/mL GA組和25μg/mL GA組藍(lán)色熒光明顯減弱,而綠色熒光增強(qiáng),說(shuō)明活細(xì)胞減少而凋亡細(xì)胞增多,紅色熒光也明顯減弱,說(shuō)明線粒體膜電位有所降低。而與10μg/mL GA組和25μg/mL GA組相比,10μg/mL GA+NAC組和25μg/mL GA+NAC組藍(lán)色和紅色熒光有所增強(qiáng),綠色熒光減弱,說(shuō)明GA+NAC組細(xì)胞凋亡減少,線粒體膜電位有所恢復(fù)。

A:Control組;B:10μg/mL GA組;C:25μg/mL GA組;D:10μg/mL GA+NAC組;E:25μg/mL GA+NAC組;1:Hoechest 33342;2:Annexin V-FITC;3:Mito-Tracker Red CMXRos;4:Merge圖5 HepG2細(xì)胞的線粒體膜電位及細(xì)胞凋亡情況

3 討 論

隨著老齡化進(jìn)程的加速和環(huán)境污染因素的加重,未來(lái)惡性腫瘤的發(fā)病率可能會(huì)更加嚴(yán)重。在癌癥的臨床治療中,大多數(shù)患者不能耐受化療帶來(lái)的嚴(yán)重不良反應(yīng),且許多患者在長(zhǎng)期使用化療藥物后出現(xiàn)耐藥性和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。因此,探索新的治療藥物和作用機(jī)制是治療癌癥的關(guān)鍵。

細(xì)胞凋亡是生物體內(nèi)細(xì)胞在特定的內(nèi)源和外源信號(hào)誘導(dǎo),并在有關(guān)基因的調(diào)控下發(fā)生的程序性死亡過(guò)程,它對(duì)生物體的正常發(fā)育、自穩(wěn)態(tài)的平衡以及各種病理過(guò)程有重要意義[8]。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡,在癌癥的預(yù)防和治療中可能發(fā)揮著重要的作用[9]。關(guān)于細(xì)胞凋亡與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展的報(bào)道很多,GA也因其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用受到眾多學(xué)者青睞,包括非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞[10]、人宮頸癌HeLa細(xì)胞[11]、黑素瘤A375細(xì)胞[12]、膀胱癌T24細(xì)胞[13]等。但對(duì)于不同的腫瘤類型,GA及其衍生物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的途徑又不盡相同。在非小細(xì)胞肺癌中,GA通過(guò)抑制EGFR的活化和損傷CARM1與PELP1的結(jié)合[14];在人卵巢癌細(xì)胞中,通過(guò)誘導(dǎo)癌細(xì)胞S期、G2期阻滯[15];在結(jié)腸癌細(xì)胞中,通過(guò)干擾JAK-STAT信號(hào)通路的運(yùn)轉(zhuǎn)[16];在黑色素瘤B16-F10細(xì)胞中,通過(guò)誘導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生,對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行阻滯[17]。據(jù)報(bào)道,GA具有促氧化[18]特性,越來(lái)越多的證據(jù)表明,GA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與源自ROS的氧化應(yīng)激有關(guān),很多GA酯(甲基、丙基和十四烷基GA酯)可誘導(dǎo)ROS增加[19-21],GA通過(guò)自氧化產(chǎn)生O2-、OH-和H2O2等ROS,誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、產(chǎn)生細(xì)胞毒性,使線粒體膜電位降低,進(jìn)而使細(xì)胞氧化磷酸化發(fā)生障礙,進(jìn)一步造成體內(nèi)ROS生成,從而引起組織細(xì)胞氧化應(yīng)激,這是引起細(xì)胞凋亡等細(xì)胞死亡的關(guān)鍵因素[24-25]。以上研究表明細(xì)胞內(nèi)ROS的水平與細(xì)胞凋亡程度密切相關(guān),有學(xué)者認(rèn)為細(xì)胞凋亡過(guò)程必然伴隨線粒體跨膜電位的下降和ROS水平的級(jí)聯(lián)性升高。有研究發(fā)現(xiàn)用GA處理肺癌細(xì)胞后,細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著增高并伴隨線粒體膜電位消失,引起促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白表達(dá)失衡,從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡顯著增高[25]。

本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)GA能夠引起肝癌HepG2、胃癌SGC7901及結(jié)腸癌EC109細(xì)胞內(nèi)的ROS水平升高,線粒體膜電位降低,細(xì)胞凋亡增多,加入抗氧化劑NAC后伴隨著ROS的產(chǎn)生被抑制,線粒體膜電位也有所恢復(fù),細(xì)胞凋亡水平降低。這些結(jié)果表明GA作為促氧化劑可以影響細(xì)胞中ROS水平,但其在GA誘導(dǎo)細(xì)胞死亡中的確切作用需要進(jìn)一步研究?？傊?GA抑制肝癌HepG2、胃癌SGC7901及結(jié)腸癌EC109細(xì)胞的生長(zhǎng)。GA誘導(dǎo)的細(xì)胞通過(guò)凋亡而死亡,伴隨著ROS增加和線粒體膜電位降低。這正好說(shuō)明了GA可以通過(guò)激活內(nèi)源性凋亡途徑來(lái)誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡,這些開創(chuàng)性研究結(jié)果為青磚茶的保健作用提供了深厚的理論基礎(chǔ)。