王威鋒，霍思懿，張 彤，翟天翔，孫嘉琪，宋巧兮，云巾宴

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，吉林 132109）

我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)為保證畜禽等經(jīng)濟(jì)動(dòng)物健康，大量使用抗菌藥物，而這種對(duì)抗菌藥物的過(guò)度與不規(guī)范使用，使我國(guó)成為世界上畜禽病原菌耐藥情況最為嚴(yán)重的國(guó)家之一。在此背景下，針對(duì)病原菌耐藥性的研究受到越來(lái)越多科研工作者的關(guān)注。超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（extended-spectrum β-lactamase，ESBLs）是一類能水解青霉素類、頭孢菌素類、單環(huán)酰胺類的β-內(nèi)酰胺酶，能夠被克拉維酸、舒巴坦等β-內(nèi)酰胺酶抑制劑所抑制的酶，被認(rèn)為是臨床上重要的多耐藥菌[1-2]。實(shí)踐證實(shí)，新型抗菌藥物的更新革代導(dǎo)致β-內(nèi)酰胺酶種類增多，尤其是產(chǎn)ESBLs的大腸桿菌和肺炎克雷伯菌感染所導(dǎo)致發(fā)病率、死亡率增加以及治療感染的成本顯著提高，已成為臨床耐藥性細(xì)菌感染的主要問(wèn)題之一，對(duì)畜禽乃至人類的健康構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅[3-4]。只依靠對(duì)藥物化學(xué)結(jié)構(gòu)改造、研究和開(kāi)發(fā)新型抗菌藥物等手段，往往很難從根本上解決細(xì)菌耐藥性的問(wèn)題，只有從多方面開(kāi)展飼料端“禁抗”，養(yǎng)殖端“限抗”，并以植物提取物“替抗”，才有可能為全面“飼料禁抗”做好準(zhǔn)備，從而減少由于抗生素濫用造成的危害[5]。中藥作為人類文明的瑰寶，成分復(fù)雜，不易導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥突變，具有抗菌藥物不能比擬的優(yōu)勢(shì)。研究表明，中藥對(duì)產(chǎn)ESBLs致病菌有一定的抑殺作用，且不易產(chǎn)生耐藥性，極具開(kāi)發(fā)潛力[6-8]。因此，發(fā)掘具有抗耐藥活性的中藥是解決細(xì)菌耐藥性、防控產(chǎn)ESBLs致病菌感染問(wèn)題的重要研究方向[9-10]。

本研究通過(guò)探索小檗堿、黃芩苷、沒(méi)食子酸、異甘草酸、原兒茶酸及丁香酚6種中藥活性成分對(duì)吉林地區(qū)豬源產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌抑菌效果，并將候選提取物與常用抗菌藥物聯(lián)合應(yīng)用，以觀察產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌對(duì)抗菌藥物敏感性的變化，為吉林地區(qū)仔豬感染產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的治療、推動(dòng)抗菌藥物的適量與規(guī)范使用及保障動(dòng)物產(chǎn)品安全提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株：產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌分離自吉林市一病死豬，經(jīng)分離鑒定后，保存于吉林省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院藥理與病理實(shí)驗(yàn)室。

供試試劑：中藥提取物小檗堿（A052）、黃芩苷（A0016）、沒(méi)食子酸（A0010）、原兒茶酸（A0617）、異甘草酸（A0463）、丁香酚（A0074）均購(gòu)于河南奧科標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)科技有限公司；抗菌藥物鏈霉素、恩諾沙星、亞胺培南、美羅培南、多西環(huán)素、頭孢西丁鈉、慶大霉素及安普霉素均購(gòu)于杭州微生物試劑有限公司，執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)WS/T125-1999；ESBLs顯色培養(yǎng)基購(gòu)于法國(guó)科瑪嘉。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌耐藥性測(cè)定 采用（K-B）藥敏紙片擴(kuò)散法檢測(cè)產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌對(duì)不同抗菌藥物的敏感程度。取保存菌液10 μL于10 mL LB液體培養(yǎng)基中37 ℃震蕩培養(yǎng)6 h，吸取100 μL均勻涂板于LB瓊脂培養(yǎng)基，3～5 min后用眼科鑷將藥敏紙片（頭孢曲松、青霉素、頭孢他啶、四環(huán)素、慶大霉素、紅霉素、諾氟沙星、左旋氧氟沙星、多西環(huán)素、磺胺異噁唑）貼于LB平板上，倒置并放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱17 h，測(cè)定抑菌環(huán)直徑，根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）2017年標(biāo)準(zhǔn)，判斷其對(duì)抗菌藥物的耐藥性[11]。

1.2.2 中藥活性成分及常用抗菌藥物對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌最小抑菌濃度（MIC）測(cè)定 采用倍比稀釋法，將小檗堿、黃芩苷、沒(méi)食子酸、原兒茶酸、異甘草酸及丁香酚6種中藥活性成分在96孔板中稀釋至終濃度為0、1、2、4、8、16、32、64、128、256、512 μg/mL，并依次在對(duì)應(yīng)的孔中加入濃度為1.0×105 cfu/mL的菌懸液10 μL，每孔終體積為200 μL。其中第11孔為陽(yáng)性對(duì)照，無(wú)藥物處理；第12孔為陰性對(duì)照，僅加入LB液體培養(yǎng)基。37 ℃培養(yǎng)16 h后用酶標(biāo)儀檢測(cè)620 nm處吸光度，計(jì)算中藥活性成分的MIC[12]。

1.2.3 常用抗菌藥物對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌MIC測(cè)定 采用二倍稀釋法，將鏈霉素、恩諾沙星、亞胺培南、美羅培南、多西環(huán)素、頭孢西丁鈉、慶大霉素、安普霉素8種抗菌藥物按其初始濃度倍比稀釋，操作步驟同1.2.2。

1.2.4 中藥活性成分聯(lián)合常用抗菌藥物抗菌效果 由于中藥有效成分的亞抑菌濃度對(duì)菌株沒(méi)有抑制或殺滅作用，因此可在亞抑菌濃度時(shí)探究中藥有效成分改變耐藥菌敏感性方面的效果。聯(lián)合傳代是以中藥有效成分的亞抑菌濃度（1/2MIC）聯(lián)合2倍MIC的抗菌藥物（鏈霉素、恩諾沙星、亞胺培南、美羅培南、多西環(huán)素、頭孢西丁鈉、慶大霉素、安普霉素）來(lái)觀察抗菌藥物MIC的變化過(guò)程。將1 mg/mL的中藥有效成分貯存液以亞抑菌濃度稀釋至96孔板中，隨后將抗菌藥物以2MIC二倍稀釋至96孔培養(yǎng)板中，加入1×105 cfu/mL菌液10 μL，37 ℃恒溫箱培養(yǎng)16 h，檢測(cè)620 nm處吸光度；在隨后的第二代及第三代培養(yǎng)過(guò)程中，抗菌藥物與中藥活性成分稀釋操作同上述一致，但第二代接種的菌液來(lái)自第一代培養(yǎng)液，第三代接種菌液來(lái)自第二代培養(yǎng)液。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌耐藥性

由表1可知，選取10種不同類型抗菌藥物對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌藥物敏感性進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌對(duì)慶大霉素介于耐藥與敏感之間，對(duì)另外9種抗菌藥物表現(xiàn)為耐藥，說(shuō)明產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌具有普遍耐藥性。

表1 產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌藥物敏感性鑒定結(jié)果

2.2 中藥活性成分對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的MIC

通過(guò)對(duì)中藥有效成分MIC測(cè)定可知，其對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌均有不同程度的抑菌效果，小檗堿、黃芩苷、沒(méi)食子酸及丁香酚抑菌效果較好，其中小檗堿在濃度為16 μg/mL時(shí)可完全殺菌，丁香酚在濃度為64 μg/mL時(shí)可完全殺菌，黃芩苷和沒(méi)食子酸的MIC為256 μg/mL，而原兒茶酸、異甘草酸抑菌效果較差，MIC高于512 μg/mL（見(jiàn)表2）。

表2 中藥活性成分對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的MIC

2.3 常用抗菌藥物對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的MIC

各種抗菌藥物的MIC如表3所示，選取8種抗菌藥物對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌藥物的MIC進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明美羅培南抑菌效果最好，當(dāng)其濃度達(dá)到5 μg/mL時(shí)可有效抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，安普霉素、多西環(huán)素、亞胺培南具有較強(qiáng)抗菌效果，8種抗菌物質(zhì)均具有抗菌效果，慶大霉素抗菌效果最差。

表3 抗菌藥物對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的MIC

2.4 中藥提取物亞抑菌濃度對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌增敏效應(yīng)

通過(guò)對(duì)比不同作用時(shí)間和不同藥物濃度作用下耐藥菌株對(duì)抗菌藥物敏感性的變化，小檗堿和沒(méi)食子酸對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的最佳逆轉(zhuǎn)條件如表4、表5所示。在小檗堿的亞抑菌濃度為8 μg/mL時(shí)，培養(yǎng)16 h可不同程度恢復(fù)產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌對(duì)ENR、MMP、DOX、FOX、GEN及APR敏感性，其中GEN、APR、MMP的敏感性提高百倍以上。亞抑菌濃度下的小檗堿與各個(gè)抗菌藥物聯(lián)合作用于耐藥大腸桿菌后，隨著傳代次數(shù)增加其增敏效應(yīng)更加突出，其中MMP、GEN、APR的MIC分別達(dá)到0.02、1.25、0.0234 μg/mL。

表4 亞抑菌濃度的小檗堿對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌耐藥性的影響

表5 抑菌濃度的沒(méi)食子酸對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌耐藥性的影響

當(dāng)沒(méi)食子酸的亞抑菌濃度為128 μg/mL時(shí)，培養(yǎng)16 h可不同程度恢復(fù)產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌對(duì)ENR、MMP、FOX、GEN及APR敏感性，其中GEN、APR、MMP對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的敏感性提高百倍以上。亞抑菌濃度下沒(méi)食子酸在與各個(gè)抗菌藥物聯(lián)合作用于耐藥大腸桿菌后，隨著傳代次數(shù)增加其作用更加突出。

3 討 論

目前，中藥抗菌及降低其耐藥性的研究已經(jīng)取得了一定程度的進(jìn)展[13]。生物堿類藥物苦豆子堿對(duì)耐β-內(nèi)酰胺酶的大腸埃希菌有較好的抑菌活性[14-15]。王月玲[16]研究表明硫酸黃連素對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的抑菌效果較好，硫酸黃連素的MBC為32～128 mg/mL，且與頭孢他啶的聯(lián)合用藥表現(xiàn)為相加作用。帥麗華等[17]通過(guò)體外聯(lián)合抗菌試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，黃連提取物和鹽酸小檗堿能明顯降低阿米卡星的MIC，進(jìn)而提高阿米卡星的抗菌效果。呂世明等[18]研究表明苦參堿能抑制ESBLs活性，從而降低頭孢類抗菌藥物對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的MIC。劉增援[19]從救必應(yīng)中提取的總黃酮可明顯抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)，并且隨著濃度升高呈劑量依賴性的抑菌、殺菌作用，且與CRO、CAZ、CEF、CTX、AK、FFC等聯(lián)合作用后FICI均處于0～0.5，表現(xiàn)為協(xié)同作用。可通過(guò)破壞大腸桿菌細(xì)胞壁、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，抑制或消除大腸桿菌總蛋白合成而發(fā)揮作用。黃芩苷、槲皮素及木犀草素作為黃酮類化合物可顯著降低抗菌藥物對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的MIC值，呈較好的抗菌特性。此外，石科[20]研究中連翹苷和白芍苷對(duì)大腸埃希菌均有明顯的體外抑菌效果，而白芍苷抑菌作用更強(qiáng)。呂世明等[18]研究表明，蘆薈大黃素、香紫蘇醇及大蒜素等中藥單體成分可通過(guò)降低頭孢類抗菌藥物對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的MIC，進(jìn)而協(xié)同抑制ESBLs活性，汪怡倩等[9]研究也證實(shí)了中藥對(duì)產(chǎn)ESBLs致病菌的抑殺作用，且極具開(kāi)發(fā)潛力[21-22]。由此可見(jiàn)，很多中藥有效成分均具有較強(qiáng)的抗菌活性，而與抗菌藥物聯(lián)用，能減少藥物用量，發(fā)揮協(xié)同增效作用。

本研究比較6種中藥提取物聯(lián)合抗菌藥物對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的抑菌效果，小檗堿、黃芩苷、沒(méi)食子酸及丁香酚在亞抑菌濃度時(shí)與抗菌藥物聯(lián)用對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌進(jìn)行傳代試驗(yàn)表明，菌株的MIC隨著傳代次數(shù)的增加而降低，傳代三代后MMP、GEN、APR的MIC<2 μg/mL，其最小抑菌濃度降低200倍以上，產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌在中藥活性成分亞抑菌濃度與抗菌藥物的聯(lián)合傳代培養(yǎng)中，未表現(xiàn)出耐藥程度升高，相反其耐藥程度在聯(lián)合傳代之后有所下降，表明亞抑菌濃度的中藥活性成分具有與抗菌藥物協(xié)同或相加的作用，亦可能存在亞抑菌濃度的中藥活性成分破壞或降低產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌耐藥機(jī)制及耐藥性的作用，但其作用機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

抗菌藥物與亞抑菌濃度的小檗堿、沒(méi)食子酸聯(lián)合用藥，傳代培養(yǎng)耐藥菌株之后，其抑制作用均有所增強(qiáng)。聯(lián)合傳代之后，中藥有效成分小檗堿、沒(méi)食子酸可使抗菌藥物的耐藥菌株的敏感性提高百倍以上，表明中藥活性成分可能存在增強(qiáng)耐藥菌株對(duì)抗菌藥物敏感性的效應(yīng)，但其具體的作用機(jī)制還不清楚，需進(jìn)一步探討。綜上所述，小檗堿與沒(méi)食子酸在單獨(dú)及聯(lián)合抗菌藥物對(duì)產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌均具有良好的抑制效果，可作為單獨(dú)及聯(lián)合用藥以抑制大腸耐藥菌株擴(kuò)散與傳播的備選藥物。