孟雨晴，張 涵，徐菁岐，莊科勤，盧殿杰，董文龍

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動物科技學(xué)院，吉林 132109）

犬細(xì)菌性皮膚病又稱膿皮癥，常發(fā)生在頭部、面部和四肢等部位，患處皮膚常有發(fā)紅、脫毛、結(jié)痂等癥狀，并伴有膿性皰疹、表皮增厚等現(xiàn)象，主要由偽中間型葡萄球菌（Staphylococcus pseudintermedius）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）等病原菌引起[1-2]。大部分寵物的細(xì)菌性皮膚病是一種人畜共患病，易在社區(qū)內(nèi)傳播[3]。針對寵物犬細(xì)菌性皮膚病，臨床上多用抗生素進(jìn)行治療，抗生素的濫用加速了犬源多重耐藥菌株的出現(xiàn)[4-5]。針對目前病原菌株耐藥水平不斷提升的情況，積極篩選新型替抗產(chǎn)品具有重要的意義。

細(xì)菌素是細(xì)菌在生長代謝過程中產(chǎn)生的有抑菌能力的多肽或前體肽，通過抑制肽聚糖合成、破壞細(xì)菌細(xì)胞壁、與核糖體或tRNA相互作用抑制蛋白質(zhì)合成等方式起到抑菌效果[6]。研究表明，大多數(shù)細(xì)菌素只能作用于與細(xì)菌同種不同株的細(xì)菌以及與它同源性高的細(xì)菌[7]。本研究旨在篩選出能抗犬皮膚病主要病原菌的細(xì)菌素，并對其生物學(xué)特性進(jìn)行研究，為開發(fā)新型替抗產(chǎn)品用于犬細(xì)菌性皮膚病的治療奠定良好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品來源 供試泡菜購于吉林市某市場。

1.1.2 菌株來源 標(biāo)準(zhǔn)株：金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸桿菌ATCC25922。臨床分離株：金黃色葡萄球菌S4（犬源）、金黃色葡萄球菌S5（犬源）、綠膿桿菌L1（犬源）、偽中間型葡萄球菌D1（犬源）、大腸桿菌E4（犬源）、大腸桿菌E5（犬源），以上臨床分離菌株均具有多重耐藥性。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 乳酸菌的分離純化 取適量泡菜置于MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h。吸取0.1 mL渾濁菌液至MRS平板上，涂布均勻，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。挑取菌落形態(tài)不一的單菌落，接種于MRS平板劃線純化，直至鏡檢形態(tài)單一為止。將純化后的菌株接種到MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃靜止培養(yǎng)24 h，甘油保菌，-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細(xì)菌素乳酸菌的初篩 將分離純化得到的乳酸菌以1:300的接種量接入MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱增殖培養(yǎng)24 h，室溫下10 000 r/min離心15 min后收集上清液，使用孔徑為0.22 μm的濾膜過濾，4 ℃保藏。

采用瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)：將50 μL濃度調(diào)節(jié)至OD600 ≈0.5的指示菌金黃色葡萄球菌ATCC25923涂布在MH瓊脂培養(yǎng)基上，用牛津杯在固體培養(yǎng)基上打孔（孔徑≈8 mm），無菌發(fā)酵上清液作為試驗(yàn)組（每孔加入200 μL），無菌MRS肉湯培養(yǎng)基作為對照組（每孔加入200 μL），靜止1 h后，37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h后測量抑菌圈直徑。

1.2.3 酸性物質(zhì)抑菌活性排除試驗(yàn)和過氧化氫排除試驗(yàn) 為排除過氧化氫對LP-3發(fā)酵上清液抗菌活性的干擾，取1 mL發(fā)酵上清液，用乳酸、氫氧化鈉將其pH調(diào)至過氧化氫酶的最適pH（pH=7.0），以最終濃度為0.1 mg/mL的量加入過氧化氫酶，置于37 ℃恒溫水浴鍋中水浴2 h，再將其pH調(diào)至初始狀態(tài)，以未進(jìn)行過氧化氫酶處理的上清液為對照組。以金黃色葡萄球菌ATCC25923為指示菌，采用瓊脂擴(kuò)散法對其抗菌活性進(jìn)行檢測。

為排除有機(jī)酸對LP-3發(fā)酵上清液抗菌活性的干擾，取5 mL發(fā)酵上清液，用乳酸、氫氧化鈉調(diào)節(jié)其pH至5.0，以無菌MRS液體培養(yǎng)基（調(diào)節(jié)pH至5.0）為對照組。以金黃色葡萄球菌ATCC25923為指示菌，采用瓊脂擴(kuò)散法對其抗菌活性進(jìn)行檢測。

1.2.4 16S rRNA基因序列測定 用基因組試劑盒提取DNA，PCR擴(kuò)增引物為細(xì)菌16S rRNA通用引物，引物序列為：

16S rRNA-F：5'-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，

16S rRNA-R：5'-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3'。

16S rRNA PCR產(chǎn)物通過1 %瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，其切膠純化產(chǎn)物送往生工生物工程（長春）股份有限公司測序。根據(jù)測序結(jié)果的16S rRNA序列與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源比對[8]。

1.2.5 LP-3分泌細(xì)菌素的生物學(xué)特性測定 （1）酶對細(xì)菌素的影響：菌株發(fā)酵上清液的pH調(diào)至胰蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶的最適pH（分別為7.4、7.4、6.0、2.0），加入1.0 mg/mL的酶37 ℃恒溫水浴4 h，沸水5 min使各酶的活性喪失，再將pH調(diào)回至5.0進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，以未處理發(fā)酵液作對照[9]。（2）溫度對細(xì)菌素的影響：將菌株發(fā)酵上清液的pH調(diào)至5.0分為四組，分別在60、80、100 ℃條件下水浴30 min以及121 ℃條件下水浴15 min，同時(shí)以未經(jīng)溫度處理的菌株上清液作為對照組，采用瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)[10]。（3）pH對細(xì)菌素的影響：用1 mol/L 氫氧化鈉和1 mol/L乳酸將菌株發(fā)酵上清液的pH調(diào)至4.0、6.0、7.0、9.0靜止1 h，再將其調(diào)回初始pH，采用瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。（4）抑菌譜的測定：取-80 ℃所儲存指示菌（8株）復(fù)蘇活化，接種到適宜液體培養(yǎng)基，于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，濃度調(diào)至OD600 ≈0.5，采用瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，記錄抑菌圈直徑，以期確定菌株的抑菌譜。

以上所有抑菌試驗(yàn)均重復(fù)3次，抑菌圈測量3次，結(jié)果取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離及其細(xì)菌素的初篩

從泡菜中分離出三種乳酸菌，通過抑菌試驗(yàn)篩選出一株乳酸菌（LP-3）的無菌發(fā)酵上清液對犬細(xì)菌性皮膚病的主要病原菌具有抑菌作用。LP-3在MRS瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h后形成白色突起小型菌落，菌落邊緣整齊，表面光滑，不透明，見圖1。通過對菌株LP-3進(jìn)行革蘭氏染色發(fā)現(xiàn)，該菌株為革蘭氏陽性，菌體呈桿狀，無芽孢，見圖2。

圖1 LP-3菌落形態(tài)

圖2 LP-3的革蘭氏染色鏡檢圖（1 000×）

2.2 細(xì)菌素的酸性物質(zhì)排除試驗(yàn)和過氧化氫排除試驗(yàn)

經(jīng)試驗(yàn)測定發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH=5.0時(shí)，菌株發(fā)酵上清液對指示菌金黃色葡萄球菌ATCC25923抑菌效果良好；用乳酸調(diào)節(jié)與發(fā)酵上清液pH相同的MRS肉湯，抑制金黃色葡萄球菌ATCC25923生長繁殖的效果不明顯。用過氧化氫酶處理后的上清液與對照組抑制效果相同。試驗(yàn)結(jié)果表明，LP-3發(fā)酵上清液對指示菌所表現(xiàn)的抑菌作用，不是乳酸和過氧化氫作用的結(jié)果。

2.3 16S rRNA測序結(jié)果

用細(xì)菌16S rRNA的通用引物對此菌進(jìn)行DNA擴(kuò)增，獲得大小為1 474 bp左右的片段，見圖3，經(jīng)測序后分析比對，顯示LP-3與平房乳桿菌（Lactiplantibacillus pingfangensis）的同源性為97.98%。

圖3 16S rRNA基因PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

2.4 細(xì)菌素穩(wěn)定性的測定

由表1可知，LP-3所產(chǎn)細(xì)菌素具有良好的熱穩(wěn)定性，隨溫度的升高細(xì)菌素對指示菌的抑菌能力雖逐漸降低，但對指示菌仍有較強(qiáng)的抑菌活性。在pH＝4時(shí)，細(xì)菌素對指示菌均具有抑菌活性，隨pH的升高對指示菌的抑菌能力逐漸降低，表明細(xì)菌素在酸性環(huán)境中活性較強(qiáng)。LP-3的發(fā)酵上清液對蛋白酶K敏感，而細(xì)菌素為一類有抑菌能力的多肽或前體肽，說明LP-3發(fā)酵液中的抑菌成分是一種細(xì)菌素。

表1 溫度、pH、蛋白酶對細(xì)菌素活性的影響

2.5 抑菌譜

由表2可知，LP-3細(xì)菌素對犬皮膚病主要病原菌（金黃色葡萄球菌、偽中間型葡萄球菌、綠膿桿菌、大腸桿菌）均有不同程度的抗菌作用。LP-3細(xì)菌素對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的標(biāo)準(zhǔn)株、犬皮膚病臨床分離株的抑菌效果最好，抑菌圈直徑≥30 mm。

表2 細(xì)菌素的抑菌譜

3 討 論

犬細(xì)菌性皮膚病的主要病原菌為金黃色葡萄球菌、偽中間葡萄球菌、綠膿桿菌、大腸桿菌，此類致病菌在寵物源致病菌中耐藥水平不斷提升，給犬細(xì)菌性皮膚病的治療造成極大的困難。Chai等[11]從寵物及寵物主人身上分離出的金黃色葡萄球菌，其中39.4%的金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出多重耐藥的趨勢，對青霉素的耐藥率高達(dá)72.7%，對其他抗生素也表現(xiàn)出不同程度的耐藥。施永超[12]從患膿皮癥的犬中分離出18株偽中間型葡萄球菌進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)與耐藥基因攜帶情況檢測發(fā)現(xiàn)，其中有55 %的分離株對青霉素高度耐藥，其次為四環(huán)素類與大環(huán)內(nèi)脂類藥物，耐藥率均在30 %以上，18株偽中間型葡萄球菌均攜帶耐藥基因，其中有10株分離株含有aacAaphD。何玉菲[13]分離出的偽中間葡萄球菌對氨芐西林和羅紅霉素的耐藥性較高，可達(dá)65.57 %和65.30%。Dégi等[14]在犬淺層表皮分離出58株綠膿桿菌，其中有31株對頭孢他啶耐藥，有30株對氨曲南耐藥。致病性大腸桿菌可通過呼吸道和消化道在狗群中傳播，造成犬大腸桿菌病?；疾〉娜S便常為稀便，會污染肛門、尾巴及后腿部位[15]。臨床上多用抗生素治療犬細(xì)菌性皮膚病，犬源性致病菌的耐藥性逐年提升，為此尋找抗生素的替代品刻不容緩。

乳酸菌是一種普遍認(rèn)為安全的常見微生物，容易獲得且易于分離純化。乳酸菌所產(chǎn)細(xì)菌素具有良好的熱穩(wěn)定性和對酸、鹽、酶的耐受性[16]。乳酸菌細(xì)菌素還具有高效、廣譜、安全等優(yōu)點(diǎn)，能有效抑制致病菌和腐敗菌[17]。目前國內(nèi)外對細(xì)菌素的研究尚處于初級階段，對寵物的致病菌進(jìn)行細(xì)菌素抑菌試驗(yàn)本試驗(yàn)尚屬首次。本研究從吉林省的自制泡菜中分離出一株能產(chǎn)細(xì)菌素的平房乳桿菌（LP-3），研究發(fā)現(xiàn)LP-3抑菌譜較廣，對犬皮膚病主要病原菌（金黃色葡萄球菌、偽中間型葡萄球菌、綠膿桿菌）均有不同程度的抗菌作用。LP-3的抑菌物質(zhì)在酸性環(huán)境中活性較強(qiáng)，隨pH的升高對指示菌的抑菌能力逐漸降低，這與任世英等[18]的研究結(jié)果相似，說明在高pH值下抑菌活性丟失，可能是由于pH變化會使抑菌物質(zhì)構(gòu)象發(fā)生變化，從而引起抑菌活性降低甚至消失；本研究中LP-3的抑菌物質(zhì)，與張君超等[19]對植物乳桿菌的研究結(jié)果相似，可見其乳酸菌所產(chǎn)細(xì)菌素在蛋白酶K等作用后水解失去全部活性，表明其具有蛋白質(zhì)特性。根據(jù)排酸、排過氧化氫、蛋白酶實(shí)驗(yàn)LP-3發(fā)酵上清除了酸和過氧化氫，還有其它抑菌物質(zhì)，并且具有蛋白特性，因此本研究中的抑菌物質(zhì)初步判定為細(xì)菌素。菌株LP-3豐富了產(chǎn)細(xì)菌素菌株資源，為研究防治犬細(xì)菌性皮膚病的新型藥物奠定基礎(chǔ)，并有著廣闊的應(yīng)用前景。