賴思含,何 瑩,易 海

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是最常見(jiàn)的急性白血病,占急性白血病的80%[1]。阿糖胞苷和柔紅霉素(daunorubicin,DNR)組合是治療AML的一線方案[2]。盡管大量的AML患者通過(guò)這種治療實(shí)現(xiàn)了初始誘導(dǎo)緩解,但化療耐藥性仍然是治療失敗的關(guān)鍵因素[3]。因此,探索AML化療耐藥的潛在機(jī)制并開(kāi)發(fā)有效的新策略至關(guān)重要。微小RNA(microRNAs,miRNAs)是一個(gè)高度保守的內(nèi)源性非編碼RNA,可通過(guò)與3′-非翻譯區(qū)(3′-untranslated region,3′-UTR)結(jié)合降解或阻斷靶基因mRNA翻譯,從而負(fù)向調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。越來(lái)越多的證據(jù)表明,miRNAs通過(guò)調(diào)節(jié)涉及細(xì)胞存活、增殖、分化和凋亡的多種靶基因的表達(dá),在AML治療中發(fā)揮關(guān)鍵作用[4,5]。有研究發(fā)現(xiàn),微小RNA-29b(microRNA-29b,miR-29b)可通過(guò)負(fù)靶向調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3抑制AML細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[6],但miR-29b在AML化療耐藥中的機(jī)制尚不清楚。通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),卷曲蛋白6(frizzled-6,FZD6)是miR-29b潛在靶標(biāo)基因,且已有研究證實(shí),FZD6參與調(diào)控AML的發(fā)病機(jī)制[7]。本研究旨在探討miR-29b靶向FZD6參與AML細(xì)胞DNR耐藥的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要試劑 AML細(xì)胞系HL-60、KG-1、THP-1和Kasumi-1購(gòu)自中國(guó)上海科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

DNR(28008-55-1,純度98%)購(gòu)自上海Chemesky,RPMI-1640培養(yǎng)液(PM150110A,含青/鏈霉素)購(gòu)自武漢Procell,miR-29b模擬物(miR-29b mimics)及其陰性對(duì)照(miR-NC mimics)、FZD6過(guò)表達(dá)載體(pcDNA-FZD6)及其空載體陰性對(duì)照(pcDNA)、3′-UTR FZD6野生型(FZD6-WT)和FZD6突變型(FZD6-MUT)均由上海生工設(shè)計(jì)并合成。Lipo 2000轉(zhuǎn)染試劑(11668-019)、一抗FZD6(720414,79 kDa)和GAPDH(MA1-16757,36 kDa)購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher,CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(BB-4202)購(gòu)自上海BestBio,TRIzolTM試劑(CY80286)購(gòu)自上海超研,反轉(zhuǎn)錄試劑盒(CD-102539GM)購(gòu)自武漢純度,SYBRTMPrimeScript RT-PCR試劑盒(RR064B-1)購(gòu)自日本TAKARA,雙分子熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(DD1205-01)、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(E112-01)、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒(A211-01)購(gòu)自南京Vazyme,RIPA裂解液(JN0191-YJR)、Edu法細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(KFS342)購(gòu)自北京百奧萊博。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 AML細(xì)胞系HL-60、KG-1、THP-1和Kasumi-1維持在RPMI-1640培養(yǎng)液中(含胎牛血清和青/鏈霉素),在37 ℃和5%CO2的濕潤(rùn)氛圍中培養(yǎng)。DNR溶解在二甲亞砜(DMSO)中。對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的HL-60、KG-1、THP-1和Kasumi-1使用不同濃度的(0、2、4、8、16 mM)[8]DNR處理培養(yǎng)24 h。

取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的THP-1細(xì)胞分為5組:Control組、miR-NC mimics組、miR-29b mimics組、miR-29b mimics+pcDNA組、miR-29b mimics+pcDNA-FZD6組。Control組細(xì)胞正常培養(yǎng);miR-NC mimics組細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-NC mimics;miR-29b mimics組細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-29b mimics;miR-29b mimics+pcDNA組轉(zhuǎn)染miR-29b mimics+pcDNA;miR-29b mimics+pcDNA-FZD6組細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-29b mimics+pcDNA-FZD6。轉(zhuǎn)染方法均按照試劑盒說(shuō)明書操作轉(zhuǎn)染24 h。以上5組細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功后均使用10 mM DNR處理培養(yǎng)24 h。

1.2.2 CCK-8檢測(cè)AML細(xì)胞增殖活性 將按照上述培養(yǎng)的不同AML細(xì)胞及DNR處理的各組THP-1細(xì)胞以1×104個(gè)/孔的密度接種在96孔板中,培養(yǎng)48 h后,根據(jù)制造商說(shuō)明書使用CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活力。通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔細(xì)胞在450 nm處的吸光度(absorbance,A值),同時(shí)計(jì)算DNR對(duì)不同AML細(xì)胞產(chǎn)生50%生長(zhǎng)抑制的濃度(IC50)。細(xì)胞增殖率=A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組×100%。

1.2.3 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)miR-29b和FZD6 mRNA 使用TRIzolTM試劑從按照上述方法培養(yǎng)的不同AML細(xì)胞及DNR處理的各組THP-1細(xì)胞中提取總RNA,使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒制備cDNA,通過(guò)SYBRTMPrimeScript RT-PCR試劑盒檢測(cè)miR-29b和FZD6 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。具體的qRT-PCR的反應(yīng)體系及程序均按照試劑盒說(shuō)明書操作。以2-ΔΔCt來(lái)表示目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。

引物序列:miR-29b,上游引物5′-GGTACCGGTTGTCTTGGGTTTATTG-3′,下游引物5′-GAATTCAAATACTTCAGAGCTG-3′;U6,上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′;FZD6,上游引物5′-ATGGAAAGGTCCCCGTTTCTG-3′,下游引物5′-GGGAAGAACGTCATGTTGTAAGT-3′;GAPDH,上游引物5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′,下游引物5′-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3′。

1.2.4 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)miR-29b與FZD6靶向關(guān)系 經(jīng)ENCORI(http://starbase.sysu.edu.cn/)網(wǎng)站預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),FZD6 mRNA的3′-UTR與miR-29b存在相互結(jié)合位點(diǎn)。取按照正常方法培養(yǎng)的THP-1細(xì)胞,將FZD6-WT和FZD6-MUT分別連接到pGL3載體后分別與miR-NC mimics或miR-29b mimics轉(zhuǎn)染,依次作為miR-NC mimics+FZD6-WT組、miR-29b mimics+FZD6-WT組、miR-NC mimics+FZD6-MUT組和miR-29b mimics+FZD6-MUT組,通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)各組細(xì)胞的熒光素酶活性。

1.2.5 免疫印跡(Western blot)檢測(cè)THP-1細(xì)胞中FZD6水平 使用RIPA試劑從按照上述方法培養(yǎng)的DNR處理的各組THP-1細(xì)胞中提取總蛋白,通過(guò)BCA法對(duì)蛋白濃度進(jìn)行定量。通過(guò)10% SDS-PAGE分離蛋白,使用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,添加5%脫脂牛奶室溫孵育2 h,添加按照1∶1000比例稀釋的FZD6和GAPDH一抗在4 ℃過(guò)夜孵育,隔天使用PBS沖洗膜后,添加按照1∶5000比例稀釋的HRP標(biāo)記二抗室溫孵育2 h,采用ECL發(fā)光液顯影后使用凝膠成像系統(tǒng)拍照,通過(guò)Image J軟件分析各蛋白的灰度值,FZD6蛋白相對(duì)表達(dá)量=FZD6灰度值/GAPDH灰度值。

1.2.6 Edu法檢測(cè)THP-1細(xì)胞增殖情況 將按照上述方法培養(yǎng)的DNR處理的各組THP-1細(xì)胞接種于6孔板中(2×105個(gè)/孔),培養(yǎng)48 h后,按照Edu法細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒中操作方法測(cè)定細(xì)胞增殖,細(xì)胞核使用5 mg/ml Hoeschst 3433染色30 min。Edu陽(yáng)性細(xì)胞呈綠色,Hoeschst 3433細(xì)胞呈藍(lán)色。Edu陽(yáng)性細(xì)胞率=綠色細(xì)胞/藍(lán)色細(xì)胞×100%。

1.2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)THP-1細(xì)胞凋亡率 將按照上述方法培養(yǎng)的DNR處理的各組THP-1細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(2×105個(gè)/孔),培養(yǎng)48 h后,分別添加100 ml結(jié)合緩沖液和5 ml Annexin V-FITC室溫避光孵育30 min后,加入10 ml碘化丙啶(PI)避光孵育5 min。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各孔細(xì)胞的凋亡率。

2 結(jié) 果

2.1 miR-29b表達(dá)與AML細(xì)胞中DNR耐藥性的相關(guān)性 結(jié)果顯示,不同AML細(xì)胞系對(duì)DNR的耐藥性不同,其增殖率隨著DNR濃度的增高而降低(表1),呈現(xiàn)濃度依賴性;且THP-1、KG-1、HL-60和Kasumi-1細(xì)胞的IC50分別為10.470、7.994、6.319和4.927 mM。qRT-PCR結(jié)果顯示,miR-29b在AML細(xì)胞系THP-1(1.00±0.05)、KG-1(1.87±0.16)、HL-60(2.96±0.21)及Kasumi-1(3.73±0.29)中的表達(dá)逐漸增高(P<0.05)。后續(xù)研究選用AML細(xì)胞耐DNR更高的THP-1細(xì)胞為研究對(duì)象,選擇藥物處理濃度為10 mM。

表1 CCK-8測(cè)定AML細(xì)胞在不同DNR濃度下的細(xì)胞增殖率

2.2 miR-29b與FZD6靶向關(guān)系驗(yàn)證 經(jīng)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),FZD6 mRNA的3′-UTR存在miR-29b的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)(圖1)。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示,與miR-NCmimics+FZD6-WT組相比,miR-29b mimics+FZD6-WT組細(xì)胞中相對(duì)熒光素酶活性顯著降低(1.01±0.02vs.0.32±0.04,P<0.05);與miR-NC mimics+FZD6-MUT組相比,miR-29b mimics+FZD6-MUT組細(xì)胞中相對(duì)熒光素酶活性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(0.98±0.06vs.1.00±0.05)。

圖1 miR-29b與FZD6靶向結(jié)合位點(diǎn)圖

2.3 miR-29b和FZD6在DNR處理的各組THP-1細(xì)胞中的表達(dá)水平 與miR-NC mimics組相比,miR-29b mimics組THP-1細(xì)胞中miR-29b表達(dá)水平增高,FZD6 mRNA和蛋白水平降低(P<0.05);與miR-29b mimics+pcDNA組相比,miR-29b mimics+pcDNA-FZD6組THP-1細(xì)胞中miR-29b表達(dá)變化無(wú)差異,FZD6 mRNA和蛋白水平增高(P<0.05);而miR-NC mimics組與Control組、miR-29b mimics+pcDNA組與miR-29b mimics組miR-29b和FZD6表達(dá)水平變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖2、表2)。

圖2 Western blot檢測(cè)各組THP-1細(xì)胞中FZD6蛋白水平A. Control;B. miR-NC mimics;C. miR-29b mimics;D. miR-29b mimics+pcDNA;E. miR-29b mimics+pcDNA-FZD6。

表2 miR-29b和FZD6在DNR處理的各組THP-1細(xì)胞中的表達(dá)水平

2.4 DNR處理的各組THP-1細(xì)胞增殖情況 與miR-NC mimics組相比,miR-29b mimics組THP-1細(xì)胞增殖率和Edu陽(yáng)性細(xì)胞率降低(P<0.05);與miR-29b mimics+pcDNA組相比,miR-29b mimics+pcDNA-FZD6組THP-1細(xì)胞增殖率和Edu陽(yáng)性細(xì)胞率增高(P<0.05);而miR-NC mimics組與Control組、miR-29b mimics+pcDNA組與miR-29b mimics組細(xì)胞增殖率和Edu陽(yáng)性細(xì)胞率變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖3、表3)。

圖3 Edu測(cè)定DNR處理的各組THP-1細(xì)胞增殖變化A. Control;B. miR-NC mimics;C. miR-29b mimics;D. miR-29b mimics+pcDNA;E. miR-29b mimics+pcDNA-FZD6。

表3 CCK-8和Edu檢測(cè)DNR處理的各組THP-1細(xì)胞增殖情況 (%)

2.5 DNR處理的各組THP-1細(xì)胞凋亡率分析 與miR-NC mimics組相比,miR-29b mimics組THP-1細(xì)胞凋亡率增高(42.65%±4.08%vs.10.04%±1.96%,P<0.05);與miR-29b mimics+pcDNA組相比,miR-29b mimics+pcDNA-FZD6組THP-1細(xì)胞凋亡率降低(19.62%±3.54%vs.45.09%±4.56%,P<0.05);而miR-NC mimics組與Control組、miR-29b mimics+pcDNA組與miR-29b mimics組細(xì)胞凋亡率變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖4)。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DNR處理的各組THP-1細(xì)胞凋亡狀況A. Control;B. miR-NC mimics;C. miR-29b mimics;D. miR-29b mimics+pcDNA;E. miR-29b mimics+pcDNA-FZD6。

3 討 論

由于對(duì)阿糖胞苷聯(lián)合DNR的標(biāo)準(zhǔn)誘導(dǎo)化療耐藥,AML在大多數(shù)情況下仍具有較差的長(zhǎng)期生存率和高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)[8,9]。因此,有必要對(duì)AML耐藥機(jī)制進(jìn)行研究,以期為提高DNR的治療效果提供依據(jù)。

既往研究表明,miRNA異常表達(dá)參與包括血液惡性腫瘤在內(nèi)的多種癌癥發(fā)生發(fā)展過(guò)程。已有大量研究表明,miR-29b可作為腫瘤抑制因子參與多種腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡及耐藥性等生物學(xué)過(guò)程,同時(shí)在機(jī)體的適應(yīng)性免疫應(yīng)答反應(yīng)中也具有重要作用,有望成為癌癥的新型診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)[10]。據(jù)報(bào)道,miR-29b在子宮頸癌細(xì)胞中通過(guò)直接調(diào)控磷酸酶和張力蛋白同源物抑制腫瘤細(xì)胞的增殖并減少遷移和侵襲,同時(shí)還通過(guò)調(diào)控Bax和Bcl-2來(lái)增強(qiáng)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性并增強(qiáng)順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[11]。miR-29b的表達(dá)在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中下調(diào)[12],可通過(guò)直接靶向抑制信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng),促進(jìn)其凋亡,同時(shí)增強(qiáng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)替莫唑胺的敏感性[12]。此外,miR-29b已被證實(shí)在AML及慢性淋巴細(xì)胞白血病中下調(diào),且其表達(dá)水平的降低與AML進(jìn)展相關(guān),過(guò)表達(dá)miR-29b可增強(qiáng)AML細(xì)胞凋亡[13,14]。本研究首先通過(guò)對(duì)不同AML細(xì)胞系對(duì)DNR耐藥性的研究發(fā)現(xiàn),不同AML細(xì)胞系對(duì)DNR的敏感性不同;同時(shí)通過(guò)檢測(cè)不同AML細(xì)胞系中的miR-29b表達(dá)發(fā)現(xiàn),對(duì)DNR耐藥性高的細(xì)胞系顯示出較低的miR-29b表達(dá),表明miR-29b表達(dá)與AML細(xì)胞中DNR耐藥性呈現(xiàn)負(fù)相關(guān),暗示了miR-29b過(guò)表達(dá)可作為提高AML對(duì)DNR敏感性的證據(jù),因此推測(cè),高表達(dá)miR-29b可以降低AML細(xì)胞中的DNR耐藥性。為進(jìn)一步證實(shí)AML細(xì)胞中miR-29b表達(dá)和DNR耐藥性的關(guān)聯(lián),我們通過(guò)用miR-29b模擬物來(lái)過(guò)表達(dá)miR-29b,結(jié)果顯示,miR-29b過(guò)表達(dá)可降低AML細(xì)胞的增殖能力,增強(qiáng)細(xì)胞的凋亡能力,這些結(jié)果表明,miR-29b表達(dá)的上調(diào)可以恢復(fù)AML細(xì)胞對(duì)DNR的敏感性,降低DNR耐藥性。

雖然上調(diào)miR-29b可以部分緩解AML細(xì)胞中的DNR抗性,但此種現(xiàn)象的分子機(jī)制還未可知。本研究使用生物信息學(xué)方法來(lái)預(yù)測(cè)miR-29b的潛在靶標(biāo),結(jié)果顯示,FZD6含有miR-29b的靶標(biāo)結(jié)合位點(diǎn),為進(jìn)一步確認(rèn)二者的關(guān)系,通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)、qRT-PCR及Western blot檢測(cè)證明,FZD6確為AML細(xì)胞中miR-29b的直接靶標(biāo)基因。FZD6屬于卷曲家族,已被證明在癌細(xì)胞增殖、凋亡中具有重要的作用。如:非編碼RNA可通過(guò)靶向調(diào)控FZD6激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路,從而參與調(diào)控膀胱癌、結(jié)直腸癌等癌癥惡性生物學(xué)行為[15,16]。且有研究表明,FZD6可觸發(fā)激活Wnt信號(hào)參與調(diào)控T細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病和AML發(fā)病機(jī)制,可作為治療的潛在靶點(diǎn)等[7, 17]。此外,已有研究證實(shí),miR-29b可通過(guò)靶向下調(diào)FZD6表達(dá)來(lái)抑制成纖維細(xì)胞增殖、遷移和分化[18]。然而,FZD6在AML耐藥機(jī)制中的作用以及miR-29b和FZD6在AML中的關(guān)系尚不清楚。本研究證明了在過(guò)表達(dá)miR-29b的AML細(xì)胞中上調(diào)FZD6表達(dá),可顯著降低AML細(xì)胞對(duì)DNR的敏感性,增強(qiáng)細(xì)胞增殖能力,抑制細(xì)胞凋亡能力,說(shuō)明上調(diào)FZD6可逆轉(zhuǎn)miR-29b對(duì)AML細(xì)胞耐藥性的影響。

綜上,miR-29b過(guò)表達(dá)可降低AML細(xì)胞對(duì)DNR的耐藥性,此過(guò)程是通過(guò)負(fù)靶向調(diào)控FZD6實(shí)現(xiàn)的?？偟膩?lái)說(shuō),本研究提出并初步驗(yàn)證了miR-29b通過(guò)直接靶向FZD的3′-UTR區(qū)域來(lái)提高AML對(duì)DNR的敏感性,其在AML細(xì)胞中的耐藥性關(guān)系,有助于理解AML治療中涉及的潛在機(jī)制。然而,仍需更多的研究來(lái)確定miR-29b是否可以用于AML臨床治療。