付之光,李宏奇,閆茂慧,劉 晨,范崇熙

三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)是一種雌激素受體、孕激素受體和人類表皮生長因子受體-2表達(dá)陰性的乳腺癌,嚴(yán)重威脅女性生命健康[1]。TNBC尚缺乏有效的治療手段,亟待探索新靶點,研發(fā)新的靶向藥物,為TNBC治療提供新策略。CD147與TNBC發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[2],主要表現(xiàn)為:(1)在表達(dá)方面,CD147在乳腺癌分子分型中的表達(dá)在TNBC亞型的陽性率最高;(2)在功能方面,CD147是腫瘤代謝異常途徑中的關(guān)鍵分子[3]。CD147通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞糖酵解、抑制線粒體氧化呼吸等模式介導(dǎo)代謝重編程[4, 5]。本研究團(tuán)隊前期研發(fā)了首個靶向CD147的小分子抑制劑AC-73,用于阻抑肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移,隨后研發(fā)了改造化合物HA-08進(jìn)一步提高抑制腫瘤增殖的功效[6, 7]。然而,HA-08在阻斷TNBC異常增殖的分子機(jī)制尚未被闡明。本研究擬通過評估HA-08在TNBC中糖代謝重編程表型,進(jìn)一步明確其體外抑瘤活性,最終探索其可能的抑瘤機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和設(shè)備 TNBC細(xì)胞系MDA-MB-231(中科院上海細(xì)胞研究所);間羥基苯乙酸等化合物合成原料(621-37-4,阿拉丁,中國);蛋白相互作用工作站系統(tǒng)(XPR36,Bio-Rad,美國);pH檢測設(shè)備(MPV ICORN,默克,德國);雙光束紫外可見分光光度計(UV8000,元析,中國上海);蛋白免疫印跡成像系統(tǒng)(iBright CL750,Invitrogen,德國);三磷酸腺苷(ATP)酶檢測試劑盒(ab234055,abcom,美國);乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒(ab102526,abcom,美國);細(xì)胞葡萄糖攝取檢測試劑盒(ab136955,abcom,美國);乳酸排出檢測試劑盒(MAK065,默克,德國);STRING網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(www.string-db.org)。

1.2 方法

1.2.1 改造化合物HA-08的合成與鑒定 以間羥基苯乙酸和4-溴芐胺鹽酸鹽為原料,經(jīng)過?；磻?yīng)得到N-(4-溴芐基)-2-(3-羥苯基)乙酰胺(化合物1)。化合物1與苯硼酸經(jīng)取代反應(yīng)得到N-([1,1′-聯(lián)苯]-4-亞甲基)-2 -(3-羥苯基)乙酰胺(化合物2)?；衔?經(jīng)還原反應(yīng)得到3-(2-(([1,1′-聯(lián)苯]-4-亞甲基)氨基)乙基)苯酚(HA-08)。

1.2.2 表面等離子共振(SPR)實驗 應(yīng)用蛋白質(zhì)相互作用工作站Prote On XPR36 系統(tǒng)對CD147蛋白與小分子化合物進(jìn)行親和力檢測。將純化好的CD147蛋白固定于芯片上,相同濃度的小分子化合物(100 μM)離心排除氣泡后水平置于放置槽內(nèi),由進(jìn)樣器吸取進(jìn)入芯片與蛋白質(zhì)反應(yīng)。由系統(tǒng)軟件進(jìn)行分析處理計算候選化合物與CD147蛋白的響應(yīng)值(RU)。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞采用含有10% 胎牛血清及雙抗(10 μg/ml鏈霉素、100 U/ml青霉素)的DMEM培養(yǎng)液(Gibco, USA)。培養(yǎng)過程中,定期觀察細(xì)胞生長狀態(tài)。

1.2.4 糖酵解相關(guān)檢測 取對數(shù)生長期的細(xì)胞,按80%密度鋪板,貼壁過夜后,加入不同濃度候選化合物,作用24 h,完成下列糖酵解相關(guān)檢測。(1)細(xì)胞外pH檢測:加入相同濃度(30 μM)的候選化合物(AC-73,HA-01-HA-08),作用24 h后,pH檢測探針對細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行檢測,記錄 pH值。(2)細(xì)胞內(nèi)三磷酸腺苷(ATP)酶含量:不同濃度HA-08(0、30、60 μM)作用細(xì)胞24 h后,利用ATP酶檢測試劑盒評估細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)ATP水平。(3)細(xì)胞乳酸脫氫酶(LDH)含量:通過乳酸脫氫酶總活性比色法定量檢測酶活力。不同濃度HA-08(0、30、60 μM)作用細(xì)胞24 h后,實驗步驟按照檢測試劑盒說明書進(jìn)行。(4)細(xì)胞葡萄糖攝取檢測:將適宜密度的乳腺癌細(xì)胞接種于96孔板中,按照葡萄糖攝取檢測試劑盒說明書的順序依次加入指示劑作用樣品,分光光度儀(λ412 nm)檢測吸光度(OD值)。(5)細(xì)胞乳酸排出檢測:不同濃度HA-08(0、30、60 μM)作用細(xì)胞24 h后,按照檢測試劑盒說明書進(jìn)行檢測。指示劑作用樣品后,分光光度儀(λ530 nm)檢測OD值。

1.2.5 WST-1細(xì)胞增殖檢測 TNBC細(xì)胞于96孔板,給予不同濃度HA-08(0、10、20、50 μM),分別作用1、3、5、7 d,每孔加入10 μl WST-1試劑,37 ℃孵育箱2 h。分光光度儀(λ450 nm)檢測OD值。

1.2.6 免疫共沉淀 細(xì)胞裂解提取蛋白,BCA定量。取稀釋好的總蛋白500 μl加入一抗。抗原抗體4 ℃過夜。加入100 μl蛋白A瓊脂糖來捕捉抗原抗體復(fù)合物,4 ℃過夜。將樣品煮沸,10 min。4 ℃低溫離心,14 000 r/min,15 min,吸出上清待電泳時使用。

2 結(jié) 果

2.1 候選改造化合物 以CD147首個靶向抑制劑AC-73為母核,初步改造合成了30個化合物,經(jīng)過理化穩(wěn)定性初篩及NMR鑒定,獲得了結(jié)構(gòu)合理,理化性質(zhì)穩(wěn)定的8個候選化合物,分別命名為HA-01、HA-02、HA-03、HA-04、HA-05、HA-06、HA-07及HA-08(圖1)。

圖1 三陰性乳腺癌靶向抑制劑AC-73的化學(xué)結(jié)構(gòu)改造A.改造化合物合成路線圖;B. 改造化合物取代基組成。

2.2 HA-08靶向性及代謝表型鑒定 應(yīng)用SPR實驗對上述改造化合物與CD147的靶向性進(jìn)行生物學(xué)驗證。純化表達(dá)的CD147蛋白固定于GLH芯片上配制相同濃度的小分子化合物HA-01至HA-08(100 μM),并以相同濃度的AC-73作為陽性對照,通過RU值間接反應(yīng)結(jié)合力強弱。結(jié)果表明,化合物AC-73、HA-07與HA-08具有較高的RU值,提示HA-07、HA-08可能與CD147存在較強的結(jié)合能力(表1)。對候選化合物作用后的TNBC細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞外pH檢測,結(jié)果表明,與對照組相比,HA-08作用后,胞外pH升高最明顯。

表1 三陰性乳腺癌治療候選化合物與CD147結(jié)合能力及作用細(xì)胞后pH評估

2.3 糖酵解相關(guān)試驗結(jié)果 細(xì)胞內(nèi)ATP含量檢測提示,與對照組比較,HA-08削弱了TNBC細(xì)胞產(chǎn)生ATP的能力。LDH活性檢測結(jié)果表明,HA-08作用后LDH活性顯著下降。乳酸排出試驗提示,HA-08抑制TNBC細(xì)胞乳酸釋放。葡萄糖攝取試驗結(jié)果表明,HA-08降低TNBC細(xì)胞葡萄糖攝取能力。值得注意的是,HA-08的作用均呈現(xiàn)濃度依賴特性(圖2)。以上實驗均表明,HA-08能夠通過特異性結(jié)合CD147,影響TNBC細(xì)胞的糖代謝重編程。

圖2 HA-08影響三陰性乳腺癌糖代謝重編程A.化合物HA-08對ATP酶含量的影響;B.化合物HA-08對乳酸脫氫酶活性的影響;C.化合物HA-08對葡萄糖攝取的影響;D.化合物HA-08對乳酸排出的影響;Control.空白對照組;DMSO.二甲基亞砜,溶劑對照組;AC-73.靶向CD147的小分子化合物,陽性對照組;HA-08.候選化合物。

2.4 WST-1增殖抑制試驗結(jié)果 在明確HA-08介導(dǎo)TNBC糖代謝重編程后,進(jìn)一步驗證糖代謝水平的變化是否能夠影響腫瘤細(xì)胞的異常增殖能力。WST-1增殖抑制試驗結(jié)果表明,HA-08可以顯著抑制TNBC細(xì)胞的增殖,呈現(xiàn)時間-濃度梯度依賴特性(P<0.05,表2)。

表2 三陰性乳腺癌治療HA-08對MDA-MB-231細(xì)胞活性的影響

2.5 HA-08作用TNBC的分子機(jī)制探討 CD147分子是跨膜蛋白,該分子可以通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用,激活下游分子信號通路。通過String數(shù)據(jù)庫,我們在蛋白水平預(yù)測了TNBC中可能與CD147(BSG)分子存在相互作用的候選蛋白分子(圖3A)。根據(jù)評分發(fā)現(xiàn)CD147與單羧酸轉(zhuǎn)運蛋白家族的SLC16A1(MCT-1)以及SLC16A3(MCT-4)可能存在較強的相互作用。既往研究表明,MCT-1和MCT-4在腫瘤細(xì)胞糖酵解中發(fā)揮重要作用,MCT家族分子要完成此功能,還需要與CD147形成蛋白復(fù)合體[8, 9]?；谏鲜霰尘?結(jié)合前期實驗結(jié)果,我們猜想HA-08可能的分子機(jī)制是通過阻礙CD147與MCT-1或MCT-4的相互作用,進(jìn)而影響TNBC糖酵解。我們隨即應(yīng)用免疫共沉淀來進(jìn)行驗證,如圖3B所示,HA-08對CD147與MCT4的相互結(jié)合無顯著影響,但是卻對CD147-MCT1相互作用呈現(xiàn)濃度依賴性影響,隨著HA-08濃度升高,CD147與MCT1相互作用減弱,證實了假設(shè)。

圖3 三陰性乳腺癌治療HA-08作用的分子機(jī)制A.與CD147相互作用分子的數(shù)據(jù)庫預(yù)測結(jié)果示意圖;B.免疫共沉淀示意圖;BSG.重組蛋白Basigin,又名CD147;MCT1.單羧酸轉(zhuǎn)運蛋白1;MCT-4.單羧酸轉(zhuǎn)運蛋白4。

3 討 論

本研究明確了靶向CD147的小分子抑制劑HA-08在TNBC細(xì)胞中潛在治療價值,闡明了HA-08可通過阻斷CD147-MCT1相互作用,進(jìn)而影響糖代謝重編程,逆轉(zhuǎn)了TNBC進(jìn)展。

3.1 TNBC分子靶向治療策略 TNBC是具有獨特的生物學(xué)及臨床特征的乳腺癌亞型,占全部乳腺癌病理類型的12%～17%,傳統(tǒng)治療手段難以使TNBC患者從治療中獲益,預(yù)后差,復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高,病死率高[10]。腫瘤靶向治療(targeted based cancer therapy, TBCT)逐漸成為腫瘤治療領(lǐng)域的研究熱點。近年來隨著對TNBC研究的不斷深入,研究者通過尋找TNBC不同生物學(xué)特征中發(fā)揮重要作用的關(guān)鍵分子來篩選有望成為TNBC分子靶向治療的全新靶點。

3.2 CD147分子有望作為TNBC治療新靶點 CD147 分子是一個相對分子質(zhì)量50～60 kDa的跨膜糖蛋白,是免疫球蛋白超家族成員之一[11, 12]。CD147作為機(jī)體重要蛋白質(zhì)分子參與了很多生理病理過程,目前報道最多的是其在惡性腫瘤中的作用[13, 14]。一項1055例乳腺癌組織樣本免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,與正常乳腺組織相比,CD147在乳腺癌組織中表達(dá)量明顯升高[15]。CD147分子在TNBC中亦呈現(xiàn)高度表達(dá)狀態(tài)。一項251例浸潤性乳腺癌的臨床樣本研究表明,CD147在TNBC的陽性表達(dá)率為85.70%[3]。另有研究發(fā)現(xiàn),沉默CD147基因可以在一定程度上抑制MDA-MB-231細(xì)胞增殖和遷移能力[3]。以上研究表明,CD147無論從差異表達(dá)層面還是生物學(xué)表型層面,都與TNBC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),阻斷其表達(dá)可逆轉(zhuǎn)這一過程,也就是說CD147或已具備成為TNBC治療分子靶點的可能。

3.3 靶向CD147的抑制劑研究 腫瘤分子靶向藥物主要可分為以單克隆抗體為代表的生物大分子抑制劑和以小分子化合物為代表的小分子抑制劑兩大類。本研究團(tuán)隊早期研發(fā)了首個靶向CD147的單克隆抗體藥物利卡汀,用于中晚期肝癌的治療[17]。隨后團(tuán)隊解析出了CD147胞外段三維晶體結(jié)構(gòu),通過計算機(jī)輔助篩選小分子抑制劑的平臺及分子生物學(xué)驗證,成功獲得了首個靶向CD147的小分子抑制劑AC-73,用于阻抑肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。目前抗體藥物已被CFDA獲批上市,小分子抑制劑AC-73在實驗室階段呈現(xiàn)良好的抗腫瘤轉(zhuǎn)移功效,同時也暴露其出溶解性欠佳、抑制腫瘤細(xì)胞活力能力偏弱等局限性[18]。本研究在AC-73的基礎(chǔ)上通過化學(xué)改構(gòu),初步合成了一批包括HA-08在內(nèi)的候選改造化合物,初步證明了其更為優(yōu)化的廣譜抑瘤活性[6],然而其抑制腫瘤細(xì)胞活力的分子機(jī)制尚未被闡明。本研究重點關(guān)注到HA-08可以改變TNBC細(xì)胞糖代謝相關(guān)產(chǎn)物的相對含量,可以在一定程度上抑制TNBC細(xì)胞酸性物質(zhì)分泌,提示HA-08可能參與TNBC的代謝表型,HA-08的抑瘤活性可能是通過靶向CD147削弱TNBC糖酵解能力來實現(xiàn)。

3.4 CD147-MCT相互作用介導(dǎo)腫瘤代謝重編程 本研究發(fā)現(xiàn),HA-08靶向作用于CD147后,可以有效阻斷CD147與MCT1的相互作用。MCT1是單羧酸轉(zhuǎn)運蛋白超家族(MCTs)的一員[19, 20],其致癌作用主要通過影響腫瘤細(xì)胞的有氧糖酵解過程發(fā)揮作用,當(dāng)MCT1表達(dá)升高時,會加速糖酵解過程產(chǎn)生的乳酸進(jìn)行跨膜運輸?shù)郊?xì)胞外,酸化細(xì)胞外環(huán)境,同時促進(jìn)腫瘤血管生成[21]。而CD147正是MCT1蛋白實現(xiàn)乳酸轉(zhuǎn)運及維持細(xì)胞內(nèi)外酸堿平衡的重要因子之一[9, 22, 23],阻斷二者相互作用,理論上可以逆轉(zhuǎn)糖酵解過程,阻抑腫瘤發(fā)展,本研究中對HA-08的發(fā)現(xiàn)及功能機(jī)制驗證證實了這一理論,在明確CD147-MCT1被HA-08阻斷后,下游細(xì)胞內(nèi)分子信號通路或分子網(wǎng)絡(luò)進(jìn)一步發(fā)生了何種變化,仍需在下一階段研究中深入挖掘。

綜上,本研究提供了TNBC靶向治療新策略,應(yīng)用小分子抑制劑HA-08,通過阻斷CD147-MCT1相互作用,逆轉(zhuǎn)TNBC糖代謝重編程,從而阻斷TNBC細(xì)胞異常增殖。HA-08對TNBC功效及分子機(jī)制探討為后續(xù)進(jìn)行臨床前研究及臨床轉(zhuǎn)化工作奠定了理論基礎(chǔ)。