蔡玉瑩,殷繼明,寧琪琪,高玉雪,楊鵬翔,陳德喜

膽汁酸(bile acids,BAs)是一類二十四碳膽烷酸羥基衍生物的總稱,在膽固醇穩(wěn)態(tài)、脂質(zhì)吸收和腸道信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[1,2]。肝臟中合成的主要BAs是膽酸(cholic acid,CA)和鵝去氧膽酸(chenodeoxycholic acid,CDCA)[3]。在腸肝循環(huán)過(guò)程中,一部分初級(jí)BAs被微生物菌群轉(zhuǎn)化為次級(jí)BAs,如脫氧膽酸(deoxycholic acid,DCA)、石膽酸(lithocholic acid,LCA)和熊去氧膽酸(ursodeoxycholic acid,UDCA)[4-7]。目前,檢測(cè)BAs的方法有酶法[8-11]、薄層色譜法(thin-layerchromatography,TLC)[12-14]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(gas chromatography-mass spectrometer,GC-MS)[15]、高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)[16,17]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(liquid chromatography tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)等[18]。本研究建立了一種快速靈敏的LC-MS/MS法,無(wú)需衍生化,分析速度快,高通量,可以同時(shí)測(cè)定小鼠肝組織15種BAs,為科研提供了技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與動(dòng)物 Agilent 6495三重四極桿質(zhì)譜儀系統(tǒng)、Agilent 1290 型超高效液相色譜儀系統(tǒng) (美國(guó) Agilent公司);BSA224S 型微量電子天平(德國(guó) Sartorius公司);MS3 Digital 型渦旋混勻儀(德國(guó) IKA公司);Centrifuge 5424R 型高速離心機(jī)(德國(guó) Eppendorf公司);高速低溫組織研磨儀(中國(guó)武漢塞維爾生物科技有限公司)。Milli-Q Advantage 純水儀(美國(guó) Millipore公司)制備超純水(18.2 MΩ·cm);CA、DCA、CDCA、UDCA、LCA、甘氨去氧膽酸(glycodeoxycholic Acid,GDCA)、甘氨鵝去氧膽酸(glycochenodeoxycholic Acid, GCDCA)、甘氨熊去氧膽酸(glycoursodeoxycholic Acid, GUDCA)、?；悄懰?taurocholate Acid,TCA)、?；侨パ跄懰?taurodeoxycholic Acid,TDCA)、?；蛆Z去氧膽酸(taurochenodeoxycholic Acid,TCDCA)、?；切苋パ跄懰?tauroursodeoxycholic Acid,TUDCA)、?；鞘懰?taurolithocholic Acid,TLCA) 標(biāo)準(zhǔn)品及三個(gè)穩(wěn)定同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)物質(zhì) (internal standard,IS) 石膽酸-d4(lithocholic acid-d4,LCA- d4)、甘氨熊脫氧膽酸-d5(glycoursodeoxycholic Acid- d5,GUDCA-d5)、2H4-脫氧膽酸(2H4-deoxycholic acid,2H4-DCA)(中國(guó) 上海安譜實(shí)驗(yàn)科技有限公司);甘氨膽酸(glycocholic Acid,GCA)、甘氨石膽酸(glycolithocholic acid,GLCA)購(gòu)自加拿大 TRC公司。甲醇、乙腈(色譜純,Thermo Fisher公司),醋酸鹽(美國(guó) Sigma-Aldrich公司),活性炭(美國(guó) Sigma-Aldrich公司)。雄性SPF級(jí)C57BL/6小鼠,5～9周齡,體質(zhì)量為24～32 g,由北京維通達(dá)生物技術(shù)有限公司提供。嚴(yán)格遵守首都醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理和福利相關(guān)規(guī)定(倫理批件號(hào):AEEI-2021-257) 進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 稱取標(biāo)準(zhǔn)品,用甲醇溶解配制成質(zhì)量濃度均為 1 mg/mL單標(biāo)儲(chǔ)備液。以不同比例準(zhǔn)確移取各標(biāo)準(zhǔn)品溶液,制成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。用甲醇稀釋配制成11個(gè)濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液以及低、中、高三個(gè)濃度質(zhì)控溶液,其中CA、DCA、CDCA、UDCA、TCA、TDCA、TCDCA、TUDCA濃度為3.9 ng/mL～4 μg/mL,質(zhì)控濃度分別為40 ng/mL、400 ng/mL、3 μg/mL; GCA、GDCA、GCDCA、GUDCA濃度為1.95 ng/mL～2 μg/mL,質(zhì)控濃度分別為20 ng/mL、200 ng/mL、1.5 μg/mL;LCA、GLCA、TLCA濃度為0.98 ng/mL～1 μg/mL,質(zhì)控濃度分別為10 ng/mL、100 ng/mL和1 μg/mL。IS濃度為1 μg/mL。

1.3 色譜條件 色譜柱:Agilent Poroshell 120 EC C18色譜柱(100 mm×4.6 mm,2.7 μm),流動(dòng)A相為5 mmol/L醋酸銨水溶液,B相為乙腈/甲醇比例為3比2的混合溶液;梯度洗脫程序:起始40%B,0～2 min 40%B;2～8 min 60%B;8～10 min 95%B;10～13 min 95%B維持;13～15 min 40%B。流速為0.3 mL/min,柱溫30℃,自動(dòng)進(jìn)樣器溫度4℃,進(jìn)樣器體積為2 μL。

1.4 質(zhì)譜條件 采用Agilent 6495三重四極桿質(zhì)譜系統(tǒng)和電噴霧電離 (electron spray ionization,ESI)負(fù)離子模式,多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiple reaction monitoring,MRM),Nebuilzer 20 psi,Gas Flow 14 L/min,Sheath Gas Temp 250℃, sheath gas flow 11 L/min,capillary 3000 V,nozzle voltage 1500 V。

1.5 肝組織BAs檢測(cè) 精密稱取肝組織90 mg,加去離子水500 μL,加研磨珠勻漿。將肝組織以60 HZ勻漿10 min,取50 μL勻漿液加入-20℃預(yù)冷的堿性乙腈(5% NH4OH)250 μL,加入IS (1 μg/mL2H4-DCA,1 μg/mLGUDCA-d5,1 μg/mL LCA-d4)10 μL,渦旋30 min,15000 r/m離心10 min。吸取上清液100 μL,加入內(nèi)插管中,注入LC-MS/MS系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.6 空白基質(zhì)處理 稱取3只普通小鼠肝組織90 mg,加去離子水500 μL勻漿。加入活性炭(100 mg/mL)500 μL孵育30 min,去除基質(zhì)中的內(nèi)源性BAs。將混合物在16000 g下離心10 min,取出上清液600 μL,過(guò)濾,在16000 g離心1 min。去除基質(zhì)濾液,以構(gòu)建肝臟生物基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化情況 采用1 μg/mL的單標(biāo)準(zhǔn)品溶液,流速為0.30 mL/min,對(duì)15種BAs質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。應(yīng)用ESI源,在MRM模式下對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品及其IS的母離子、子離子和碰撞能量進(jìn)行逐一優(yōu)化。結(jié)果表明,在ESI負(fù)離子模式下,15種BAs和3種IS都可以獲得強(qiáng)度較高的[M-H]-準(zhǔn)分子離子峰,在二級(jí)質(zhì)譜高碰撞能量下獲得豐度較高的子離子。對(duì)于游離BAs,使用母離子定量,對(duì)甘氨結(jié)合型膽汁酸(glycine-conjugated bile acids,G-BAs)以73.9 m/z (NHCH2COOH-)為子離子,對(duì)?；墙Y(jié)合型膽汁酸(taurine-conjugated bile acids,T-BAs)以79.8 m/z(SO3-)為子離子。繼續(xù)優(yōu)化碰撞能量,使目標(biāo)化合物具有最高的靈敏度。

2.2 色譜條件的優(yōu)化情況 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),流動(dòng)A相為5 mmol/L醋酸銨水溶液,B相為乙腈甲醇(3∶2)的混合溶液,采用梯度洗脫時(shí),能夠很好地分離各類BAs,且各物質(zhì)峰形良好,具有較高的靈敏度(圖1)。醋酸銨的加入極大地提高了離子響應(yīng),將分析時(shí)間縮短到15 min,能夠快速高效地分析15種BAs,確保母離子和子離子都相同的BAs能實(shí)現(xiàn)基線分離,達(dá)到很好的定量分析效果。

圖1 15種BAs的色譜圖橫坐標(biāo)為采集時(shí)間,縱坐標(biāo)為counts(%),15種BAs的峰型良好游離BAs (以紅色顯示),其中1:CA;2:DCA;3:CDCA;4:UDCA;5:LCAG-BAs(以藍(lán)色顯示),其中6:GCA;7:GDCA;8:GCDCA;9:GUDCA;10:GLCAT-BAs (以黑色顯示),其中11:TCA;12:TDCA;13:TCDCA;14:UDCA;15:TLCA

2.3 樣本前處理的優(yōu)化 BAs屬于內(nèi)源性物質(zhì),無(wú)法直接從小鼠肝組織提取以作為空白基質(zhì)。采用模擬空白基質(zhì)與實(shí)際背景相差較大,造成檢測(cè)誤差。因此,在本研究,采用活性炭吸附法去除小鼠肝組織內(nèi)源性BAs的干擾,以獲得較為準(zhǔn)確的空白基質(zhì)。預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明吸附后的肝組織勻漿溶液均無(wú)各類BAs檢出。在已發(fā)表的研究,對(duì)肝組織前處理一般使用SPE固相萃取等方法,但這種方法耗時(shí)長(zhǎng)、成本高,不適用于大批量樣本檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)采用蛋白沉淀法,樣本經(jīng)堿性乙腈處理后離心沉淀,簡(jiǎn)化了前處理過(guò)程,提高了檢測(cè)效率。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限的確定 以活性炭處理后的空白基質(zhì)為背景,加入15個(gè)BAs和3個(gè)IS,在適當(dāng)范圍構(gòu)建11個(gè)校準(zhǔn)點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。以分析物與IS的峰面積比為縱坐標(biāo),各標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線,通過(guò)調(diào)整最佳加權(quán)因子1/X或1/X2(X是每種分析物的濃度) 分析校準(zhǔn)。結(jié)果表明,15種BAs線性良好,R2均大于0.993。以信噪比S/N=3∶1時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度確定本方法的檢出限( limit of detection,LOD),LOD均小于2ng/mL。

2.5 精密度、準(zhǔn)確度和基質(zhì)效應(yīng)情況 取空白肝組織勻漿液和各BAs標(biāo)準(zhǔn)品溶液,制備15種BAs低、中、高濃度質(zhì)控樣本,每一濃度平行操作6份,1天內(nèi)進(jìn)樣6次,以獲得日內(nèi)檢測(cè)結(jié)果,3日重復(fù)進(jìn)樣,獲得日間檢測(cè)結(jié)果,并代入線性回歸方程,計(jì)算濃度。準(zhǔn)確度計(jì)算方法為:準(zhǔn)確度(RE)=測(cè)算值-真實(shí)值/真實(shí)值×100%;精密度計(jì)算方法為:相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)=標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)/計(jì)算結(jié)果的算術(shù)平均值(X)×100%。在本方法中,15種BAs在低、中、高 QC樣本濃度下日內(nèi) RE 為-13.18 %～10.95 % ,日內(nèi) RSD 為 0.92%～11.74%;日間 RE 為-11.27%～8.58% ,日間 RSD 為2.07%～11.33%。通過(guò)比較在甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液和空白基質(zhì)溶液中,以15種BAs低、中、高 QC樣本的比值來(lái)確定基質(zhì)效應(yīng)。在本方法中,基質(zhì)效應(yīng)值為90.76%～109.25%。測(cè)定結(jié)果表明,小鼠肝組織BAs分析的準(zhǔn)確度、精密度和基質(zhì)效應(yīng)良好。

2.6 穩(wěn)定性 取空白肝組織勻漿液和各BAs標(biāo)準(zhǔn)品溶液,制備15種BAs低、中、高濃度各6份標(biāo)本,分別置于自動(dòng)進(jìn)樣器4℃24 h,反復(fù)凍融3次,-80℃冷凍保存1個(gè)月,測(cè)定結(jié)果顯示在自動(dòng)進(jìn)樣器4℃存放24 h時(shí),RE為-12.67%～7.74%, RSD為0.71%～13.28%;反復(fù)凍融3次,RE為-13.98%～10.75%,RSD為0.67%～15.53%;-80℃冷凍保存1個(gè)月,RE為-13.89%～12.89%,RSD為0.62%～15.32%。在以上三種測(cè)定條件下,樣品較穩(wěn)定,未見明顯降解,表明在這些條件下樣本均能保持穩(wěn)定。

2.7 肝組織BAs測(cè)定 應(yīng)用上述所建立的方法測(cè)定6例小鼠肝組織15種BAs含量,游離BAs主要以初級(jí)BAs的CA和CDCA為主, 次級(jí)BAs 的DCA和LCA含量較低(圖2A);G-BAs以GCA為主,甘氨酸結(jié)合型濃度較低,在線性范圍內(nèi)檢測(cè)不到GCDCA和GUDCA(圖2B);小鼠肝組織T-BAs主要以TCA和TDCA為主(圖2C);游離BAs 濃度[(723.89±50.65)ng/mL],顯著高于G-BAs[(56.90±11.28)ng/mL,P<0.001];T-BAs濃度[(40322.90±14034.80)ng/mL]顯著高于游離BAs[(723.89±50.65)ng/mL,P<0.001],也顯著高于G-BAs[(56.90±11.28)ng/mL,P<0.001,圖2D],提示小鼠肝組織BAs代謝水平的差異性和復(fù)雜性,值得深入研究。

圖2 LC-MS/MS檢測(cè)6例小鼠肝組織BAs濃度A:各游離BAs濃度; B:各G-BAs濃度; C:各T-BAs濃度;D:游離BAs、G-BAs和T-BAs濃度游離BAs與G-BAs相比, ***P<0.001;游離BAs與T-BAs相比, ***P<0.001;G-BAs與T-BAs相比,***P<0.001

3 討論

本研究基于靶向LC-MS/MS技術(shù)建立了檢測(cè)小鼠肝組織15種BAs含量的檢測(cè)方法,并進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。使用Agilent Poroshell 120 EC C18色譜柱,ESI離子源,流動(dòng)相中醋酸銨的加入,在負(fù)離子MRM模式下提高了離子化效率,改善了峰形。而過(guò)高的醋酸銨則會(huì)抑制BAs的離子化,前期實(shí)驗(yàn)表明5 mmol/L醋酸銨離子化效果最佳。

BAs屬于小鼠肝臟的內(nèi)源性物質(zhì),無(wú)法直接獲取空白基質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)中通過(guò)活性炭吸附,有效去除內(nèi)源性BAs,最大程度降低對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響,使準(zhǔn)確性顯著提高。采用乙腈蛋白沉淀的前處理方法,僅需50 μL樣本,操作簡(jiǎn)單快速,背景干凈,基質(zhì)效應(yīng)良好。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,15種BAs在其線性濃度范圍內(nèi)線性相關(guān)系數(shù) R2均大于0.993,LOD均小于2 ng/mL,基質(zhì)效應(yīng)范圍為90.76%～109.25%。準(zhǔn)確度、精密度和穩(wěn)定性均滿足生物樣本分析要求。檢測(cè)小鼠肝組織BAs,結(jié)果TCA和TDCA濃度較高。

準(zhǔn)確定量BAs亞型濃度對(duì)進(jìn)一步研究肝臟疾病具有重要意義。本研究采用LC-MS/MS檢測(cè)了小鼠肝組織15種BAs含量,結(jié)果顯示游離BAs中的初級(jí)BAs CA和CDCA濃度分別是對(duì)應(yīng)次級(jí)BAs DCA和LCA的22倍和31 倍,且初級(jí)BAs中CA是CDCA的1.25倍,符合BAs的合成過(guò)程。游離型BAs和結(jié)合型BAs(G-BAs、T-BAs)都以母體CA為主,其中TCA濃度最高,是CA的115倍或GCA的683倍。6例樣本的BAs含量存在一定的差異,尤其是T-BAs,除小鼠個(gè)體差異外,還可能是采集時(shí)膽汁的污染造成的。T-BAs是小鼠的主要BAs,符合已有研究結(jié)果,與人類或大鼠不同。在小鼠,負(fù)責(zé)BAs與氨基酸結(jié)合的酶對(duì)牛磺酸具有更強(qiáng)的親和力。