方慧晶 綜述,朱傳龍,章莉莉 審校

HBV感染已呈世界性流行。據(jù)統(tǒng)計(jì),全球每年約有88.7萬人死于HBV感染相關(guān)疾病,其中肝硬化和肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)分別占死亡原因的52%和38%。目前,HBV的治療很少能完全清除病毒,即使藥物應(yīng)答良好的患者在停藥后仍可能會(huì)出現(xiàn)病毒學(xué)復(fù)發(fā)。HBV難以清除的關(guān)鍵,一方面在于病毒的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄模板——共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)的持續(xù)存在,另一方面在于宿主免疫反應(yīng)的缺陷?，F(xiàn)有的抗病毒藥物治療局限于抑制病毒的復(fù)制,從而延緩肝臟纖維化及肝細(xì)胞肝癌的發(fā)生,然而對(duì)cccDNA的持續(xù)存在無能為力[1]。已有研究發(fā)現(xiàn),HBV cccDNA的形成依賴于宿主因子[2],HBV生命周期的完整性與宿主因素密不可分,靶向宿主的治療藥物有極大的治療潛力。由于乙型肝炎病毒株的變異,針對(duì)宿主自身因素的治療發(fā)生耐藥的風(fēng)險(xiǎn)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于針對(duì)病毒本身的藥物,同時(shí)其作用的靶點(diǎn)較僅針對(duì)病毒的藥物也更為廣闊。此外,有研究證明,新型藥物的研發(fā)及聯(lián)合使用,會(huì)增加 HBsAg 血清清除率,誘導(dǎo) HBV的功能性治愈,但具體療效仍需要大量臨床研究驗(yàn)證[3]。目前,抑制病毒進(jìn)入、破壞病毒核酸穩(wěn)定性以及增強(qiáng)宿主對(duì)HBV的免疫反應(yīng)是抗病毒藥物研發(fā)的主要思路。

1 靶向HBV進(jìn)入的宿主因素

HBV具有高度的物種特異性和嗜肝性,需要通過肝臟特異性高親和力受體——鈉離子牛黃膽酸共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(sodium-taurocholate cotransporting polypeptide,NTCP)介導(dǎo)進(jìn)入肝細(xì)胞[4]。目前已證實(shí)HBV首先在HBsAg的S域中抗原環(huán)的介導(dǎo)下,以低親和力的方式附著在肝細(xì)胞膜的硫酸肝素蛋白多糖(heparan sulfate proteoglycans,HSPGs)上。緊隨其后,L-HBsAg的PreS1域以高親和力的方式與肝細(xì)胞基底膜上的NTCP結(jié)合,此時(shí)PreS1 N端肉豆蔻化以增強(qiáng)受體識(shí)別能力從而促進(jìn)病毒感染[5]。因此,靶向NTCP及其底物介導(dǎo)的病毒入胞過程為探索抗HBV治療提供了更廣闊的思路[6]。Myrcludex B(別名Bulevirtide)是一種源自HBV preS1結(jié)構(gòu)域的合成脂肽,可與HBV競爭性結(jié)合NTCP,從而特異性阻斷病毒對(duì)正常肝細(xì)胞的感染,同時(shí)抑制已感染肝細(xì)胞內(nèi)cccDNA的生成。一項(xiàng)IIb期臨床試驗(yàn)表明,Myrcludex B +PegIFN-α治療48周后,HBV/HDV合并感染患者血清HBsAg陰轉(zhuǎn)率為27%[7]。此外,替諾福韋與Myrcludex B聯(lián)合用藥表現(xiàn)出良好的安全性和耐受性,且兩種藥物對(duì)彼此藥代動(dòng)力學(xué)穩(wěn)態(tài)無影響[8]。目前Myrcludex B正進(jìn)入III期臨床研究,研究者將對(duì)CHB患者進(jìn)行單藥治療或與PegIFN-α聯(lián)合治療的效果評(píng)估。另一種進(jìn)入抑制劑環(huán)孢菌素A(CsA)及其衍生物則是通過抑制preS1附著于NTCP而阻止病毒進(jìn)入肝細(xì)胞,CsA衍生物SCY450和SCY995僅抑制 HBV 進(jìn)入而不顯著影響 NTCP 的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能,避免發(fā)生膽汁酸攝取障礙[9]。曲格列酮從特異性抑制表皮生長因子誘導(dǎo)的NTCP寡聚化方面阻斷HBV preS1及其受體NTCP的內(nèi)化,抑制HBV感染[10]。有研究表明E-鈣粘蛋白通過與糖基化的NTCP相互作用促進(jìn)其在肝細(xì)胞中的膜定位,而敲低E-鈣粘蛋白可顯著降低HBV顆粒的感染以及HBV假顆粒進(jìn)入受感染的肝細(xì)胞和細(xì)胞系[11]。NTCP的糖基化在生物學(xué)上直接和/或間接影響HBV感染過程[12]。靶向NTCP的藥物可阻止病毒進(jìn)入未感染肝細(xì)胞,從而對(duì)肝臟形成一定的保護(hù)作用,但是其終究對(duì)已進(jìn)入細(xì)胞并開始轉(zhuǎn)錄復(fù)制的病毒束手無策,因此上述藥物勢(shì)必要聯(lián)合其他抗病毒藥物治療,達(dá)到最終的臨床治愈。

2 靶向宿主因子

2.1 靶向宿主RNA相關(guān)因子 已知HBV mRNA代謝依賴于宿主轉(zhuǎn)錄機(jī)制,影響宿主細(xì)胞mRNA代謝周期的RNA監(jiān)測(cè)和降解機(jī)制很可能同時(shí)影響HBs mRNA產(chǎn)生與降解。據(jù)報(bào)道,HBV mRNA的穩(wěn)定性,由宿主非經(jīng)典的多聚腺苷酸化聚合酶相關(guān)結(jié)構(gòu)域5和7(noncanonical poly(A) polymerase-associated domain 5 and 7,PAPD5 and PAPD7)調(diào)節(jié),在敲低PAPD5 / 7后可觀察到HepaRG細(xì)胞和原代人肝細(xì)胞中HBs顯著降低[13]。宿主蛋白PAPD5/7的主要功能是將異常的非編碼RNA(ncRNA)的3'末端寡聚腺苷酸化,進(jìn)行外泌體降解。而HBV通過劫持PAPD5 / 7的RNA腺苷酸化功能來穩(wěn)定病毒mRNA[14]。作為靶向宿主途徑調(diào)節(jié)PAPD5/7和HBV mRNA間相互作用的藥物,口服小分子二氫喹啉酮(DHQ)可通過抑制宿主PAPD5/7,誘導(dǎo)HBV RNA快速和選擇性降解,從而減少病毒基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物[15]。具有DHQ結(jié)構(gòu)的先導(dǎo)化合物RG7834已被證明可在體外和體內(nèi)選擇性地減少HBsAg、HBeAg以及HBV DNA[16]。而對(duì)于已報(bào)道的RG7834急性神經(jīng)毒性,有研究嘗試通過合成高度肝臟特異性DHQ衍生物,以限制藥物在血液中的分布,避免藥物的全身分布從而減輕甚至消除其對(duì)多臟器的毒性作用[17]。另一二氫喹酮類化合物AB-452也表現(xiàn)出HBV特異性抗病毒活性,可抑制HBV DNA復(fù)制,降低HBsAg、HBeAg的表達(dá)[18]。

2.2 靶向宿主DNA相關(guān)因子 作為HBV轉(zhuǎn)錄與復(fù)制的模板,cccDNA的產(chǎn)生和持續(xù)存在是HBV感染最關(guān)鍵的步驟之一,盡管將病毒粒子相關(guān)的松弛環(huán)狀DNA(relaxed circular DNA ,rcDNA)轉(zhuǎn)化為這種穩(wěn)定的微染色體的過程尚不完全明確,但目前已證實(shí)宿主細(xì)胞DNA合成和修復(fù)因子(如DNA修復(fù)酶TDP2或TDP相關(guān)蛋白[19],DNA聚合酶α[20],κ[21]、DNA連接酶[22]、FEN1[23]及 DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I和II)是HBV cccDNA合成中不可或缺的因素。病毒庫的沉默勢(shì)必會(huì)極大地促進(jìn)HBV的功能性治愈,因此,從宿主因子方面著手調(diào)控cccDNA生成的研究前景深遠(yuǎn)。其中,TDP2同時(shí)作為病毒蛋白解鏈酶,參與病毒轉(zhuǎn)錄和翻譯,基于此構(gòu)建高選擇性TDP2抑制劑異惡唑喹啉二酮衍生物[24],為抗HBV治療開辟了新的思路。宿主細(xì)胞DNA修復(fù)通路ATR-CHK1抑制劑AZD6738和VE-821可在體外減少cccDNA生成[25]。

除外上述抑制cccDNA產(chǎn)生的宿主因子,目前已被證實(shí)對(duì)HBV感染有負(fù)性調(diào)節(jié)作用的宿主限制因子包括NF-κB、STAT1和STAT2、PROX1、EZH2、YY1、SIRT1和 SIRT3、 PRMT1、PRMT5、HDAC1、SETDB1、 Smc5/6、ZHX2、DDX3及APOBEC3A和APOBEC3B[26]。研究表明,乙型肝炎病毒編碼調(diào)節(jié)X蛋白(HBx)通過劫持含有細(xì)胞DDB1的E3泛素連接酶來靶向降解染色體結(jié)構(gòu)維持復(fù)合物5/6(structural maintenance of chromosomes complex 5/6,Smc5/6),促進(jìn)受感染細(xì)胞染色體外病毒基因組的轉(zhuǎn)錄[27]。在有效抑制HBx的前提下, Smc5/6復(fù)合物可促進(jìn)人肝嵌合小鼠體內(nèi)HBV cccDNA沉默,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)病毒轉(zhuǎn)錄的持續(xù)抑制[28]。有研究發(fā)現(xiàn)硝唑尼特和pevonedistat (MLN 4924)[29]可阻斷Smc5/6的降解并恢復(fù)Smc5/6表達(dá),抑制HBV cccDNA轉(zhuǎn)錄,其中硝唑尼特已獲FDA批準(zhǔn)用于治療多種病毒和寄生蟲感染,但仍需要更多臨床研究進(jìn)一步評(píng)估抗病毒活性。由此可見,靶向宿主DNA修復(fù)機(jī)制的思路,極有可能成為最終消除cccDNA的治療方向。

3 靶向免疫調(diào)節(jié)

3.1 靶向固有免疫調(diào)節(jié) 模式識(shí)別受體 (pattern recognition receptor,PRR) 是宿主抗病毒免疫的第一道防線,可檢測(cè)病毒病原體的保守分子特征并通過PRR家族特異性銜接蛋白(例如,干擾素基因刺激物 (STING) 或 MYD88)以及一組絲氨酸/蘇氨酸激酶和轉(zhuǎn)錄因子的分層激活啟動(dòng)先天免疫信號(hào)傳導(dǎo)。慢性乙型肝炎患者肝臟活檢的相關(guān)研究表明,HBV可逃避病毒攜帶者的模式識(shí)別受體[30],這一特征推進(jìn)了模式識(shí)別受體靶向藥物作為潛在抗病毒治療藥物的研究。根據(jù)亞細(xì)胞定位可以將這些先天免疫傳感器分為兩大類:位于質(zhì)膜或內(nèi)體膜上識(shí)別細(xì)胞外病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular pattern,PAMP)的PRR,包括 Toll 樣受體 (Toll-like receptor,TLR) 和C型凝集素受體(C-type lectin receptors,CLR);存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中的PRR,包括NOD樣受體(NOD-like receptor,NLR)、RIG -I 樣受體(RIG-I-like receptor,RLR)及其他細(xì)胞內(nèi) DNA 傳感器[31]。

TLR介導(dǎo)通路的激活誘導(dǎo)HBV復(fù)制的抑制和HBV特異性適應(yīng)性免疫的恢復(fù)。目前研究較多的TLR7激動(dòng)劑GS-9620[32],可在漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞中誘導(dǎo)IFN-α產(chǎn)生,在慢性感染 WHV 的土撥鼠和感染 HBV 的黑猩猩中觀察到病毒載量顯著持續(xù)降低[33]。最新研究發(fā)現(xiàn)抗SIGLEC-3mAb (10C8)可以逆轉(zhuǎn) HBV介導(dǎo)的TLR 配體相關(guān)的免疫抑制并上調(diào)對(duì)抗原呈遞至關(guān)重要的表面分子。此外,10C8 與 GS-9620 具有協(xié)同作用,可上調(diào)細(xì)胞因子的產(chǎn)生以及 MHC-I、MHC-II 和共刺激信號(hào)的表達(dá)水平[34]。由于在Ib/IIa期試驗(yàn)中,單獨(dú)使用GS-9620無法達(dá)到血清HBV DNA和HBsAg水平的顯著變化[35],因此將 GS-9620和10C8 聯(lián)合使用可增強(qiáng)T細(xì)胞免疫力以清除 HBV 感染,是一種很有前景的策略?？诜LR7 激動(dòng)劑 JNJ-4964通過細(xì)胞因子介導(dǎo)的非細(xì)胞溶解機(jī)制實(shí)現(xiàn)抗HBV作用,在臨床前實(shí)驗(yàn)中觀察到劑量依賴性抗HBV活性以及全身細(xì)胞因子、B 和 T 細(xì)胞誘導(dǎo)激活[36]。TLR8激動(dòng)劑GS-9688可將土撥鼠肝內(nèi)WHV DNA和RNA 水平降低 20 倍[37]。GS-9688在人外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)中誘導(dǎo)細(xì)胞因子,通過多種免疫介質(zhì)激活抗病毒效應(yīng)功能[38]。研究發(fā)現(xiàn),用GS-9688刺激過的PBMC作為培養(yǎng)基,培養(yǎng)出的HBV感染的原代肝細(xì)胞中觀察到病毒標(biāo)志物的減少[39]。而雙重TLR 7/8 調(diào)節(jié)劑2,4-二氨基喹唑啉用于乙型肝炎病毒治療也正在研究中[40],TLR 2也被證實(shí)是HBV感染后B細(xì)胞活化所必須的。隨著TLR通路中的關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白——髓系分化初級(jí)反應(yīng)蛋白(myeloid differentiation primary response protein, MyD88)在宿主免疫信號(hào)通路中作用的發(fā)現(xiàn),靶向MyD88藥物也為抗病毒治療提供了廣泛的思路。但要達(dá)到完全清除病毒的目的,還需要更廣泛且深入的研究來確定TLR在病毒感染后機(jī)體免疫過程中的具體作用通路。

研究表明,HBV利用CLR途徑劫持樹突狀細(xì)胞(dendritic cell, DC)亞群從而逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視。因此,通過調(diào)節(jié)病毒聚糖-凝集素軸來改變病毒與宿主間的相互作用,最終觸發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)達(dá)到清除病毒效果不失為抗病毒治療的另一思路[41]。RIG-I通過識(shí)別HBV pgRNA 5' ε 區(qū)域并誘導(dǎo)III型干擾素的產(chǎn)生激活機(jī)體先天免疫,此外,RIG-I還能以RNA結(jié)合的方式,抑制聚合酶介導(dǎo)的衣殼化,達(dá)到抗病毒的效果[42]。目前已有RIG-I相關(guān)藥物進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn),據(jù)報(bào)道RIG-I/NOD2激動(dòng)劑SB 9200 (Iranigivir)可降低土撥鼠的血清WHV DNA 及WHsAg和水平[43]。

3.2 靶向特異性免疫 慢性乙型肝炎患者特異性免疫治療策略最大的挑戰(zhàn)是T細(xì)胞免疫耐受及病毒特異性T細(xì)胞耗竭。有研究表明,在CHB 患者中程序性死亡受體1 (PD-1) 等抑制性受體在T細(xì)胞上過度表達(dá),引起T細(xì)胞負(fù)性調(diào)節(jié),這可能是慢性乙型肝炎患者肝臟中T細(xì)胞耗竭出現(xiàn)病毒持續(xù)性感染難以清除的原因。在Ib 期臨床研究中,PD-1抑制劑nivolumab可導(dǎo)致大多數(shù)患者HBsAg下降[44]。PD-1抑制劑JNJ-63723283和口服PD-L1抑制劑AB-101目前已分別進(jìn)入I期臨床和臨床前試驗(yàn)。

乙型肝炎治療性疫苗BRII-179的 IIa期臨床研究表明,單獨(dú)使用或與低劑量干擾素-α 聯(lián)合使用可誘導(dǎo)增強(qiáng)CHB患者的特異性抗體和T細(xì)胞反應(yīng),但是對(duì)病毒學(xué)狀態(tài)影響較小[45]。用于治療CHB 的免疫原性疫苗的暫未能表現(xiàn)出可靠的療效,但有研究報(bào)道,樹突狀細(xì)胞受體靶向嵌合免疫治療蛋白[46]在綿羊和人的PBMCs中,可誘導(dǎo)出HBV特異性抗體并增強(qiáng)T細(xì)胞反應(yīng)[47]。通過 T 細(xì)胞受體 (TCR) 基因轉(zhuǎn)移或通過使用嵌合抗原受體 (CAR) T 細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)基因重編程以創(chuàng)建功能性 T 細(xì)胞以消除 HBV 感染的肝細(xì)胞可能是一種HBV治療新策[48]。盡管CAR-T細(xì)胞療法會(huì)降低發(fā)生HCC和肝硬化的機(jī)會(huì),但是該治療方案的生產(chǎn)和實(shí)施繁瑣、昂貴,對(duì)技能人員要求較高,暫時(shí)無法替代現(xiàn)有的抗病毒治療[49]。

4 結(jié)論與展望

慢性乙型肝炎的治療是困擾全球?qū)W者許久的重大問題,而開辟新的治療靶點(diǎn),例如NTCP及其底物、宿主PAPD5/7、TDP2以及上調(diào)機(jī)體免疫反應(yīng)等,其相關(guān)藥物已在臨床前及臨床試驗(yàn)中表現(xiàn)出較好的抗病毒活性,均可以優(yōu)化現(xiàn)有的治療方案。慢性乙型肝炎的治愈,重點(diǎn)與難點(diǎn)在于清除HBV cccDNA。因此,更準(zhǔn)確與全面的了解HBV復(fù)制的分子生物學(xué)過程,尤其是cccDNA的產(chǎn)生和降解的影響因素,將是實(shí)現(xiàn)乙型肝炎全面治愈的關(guān)鍵。同時(shí),針對(duì)HBVDNA、RNA、核衣殼及逆轉(zhuǎn)錄酶等作用機(jī)制的研究也為新型藥物研發(fā)提供了較多可靠的治療靶點(diǎn)依據(jù)。有研究表明,相較于單一藥物治療,在核苷(酸)類似物或干擾素療法的基礎(chǔ)上,加用病毒進(jìn)入抑制劑、核心蛋白變構(gòu)調(diào)節(jié)劑和轉(zhuǎn)錄抑制劑會(huì)具有更好的抗病毒效果[50],而上述新藥的研發(fā)及新藥與現(xiàn)有藥物的聯(lián)合治療也在加大力度研究中,可以想見未來慢性乙型肝炎治愈的方案必然會(huì)是針對(duì)病毒與宿主兩方面、多靶點(diǎn),同時(shí)更安全更高效。